黄瓜花叶病毒属病毒复制酶组分的异源组合对病毒基因组和亚基因组产生的影响

摘要

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和番茄不孕病毒（Tomatoaspermy virus，TAV）同属于雀麦花叶病毒科(Bromovirus)，黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus），是一类重要的植物病原。这两种病毒基因组都是由3条正义单链RNA构成，其中基因组RNA1和RNA2分别编码1a蛋白和2a蛋白，组成病毒复制复合体(Replication complex，RC)，参与病毒的合成与复制。RNA2的亚基因组RNA4A编码一种多功能2b蛋白，它是病毒的致病决定因子，同时也是RNA沉默抑制子。在自然界中，不同种植物病毒往往能够复合侵染植物，导致植物产生更加严重的病毒症状，甚至有可能产生重组病毒，这也是病毒进化的重要手段之一。
　　本文通过黄瓜花叶病毒和番茄不孕病毒基因组之间的交换，形成基因组假重组体，利用农杆菌介导的方法，探索调控亚基因组RNA4A合成的CMV1a蛋白功能结构域，以及异源复制酶对于病毒基因组和亚基因组RNA在寄主内复制的影响。
　　通过CMV和TAV病毒基因组RNA的交换，发现TAV RNA1与CMVRNA2的异源组合，不能有效合成亚基因组RNA4A。荧光观察结果和Westernblot结果证实，异源复制复合体TAV1 a/CMV2a只有合成少量亚基因组RNA4A。我们猜测CMV1a蛋白在识别和合成CMV亚基因组RNA4A的过程中，起到至关重要的作用。1a蛋白含有两个结构域，解旋酶结构域和甲基转移酶结构域。将CMV1a与TAV1a的完整或部分蛋白功能结构域进行互换，都无法有效的合成亚基因组RNA4A。
　　利用基于T-DNA的病毒基因表达方法，分析CMV和TAV基因组RNA的互换对病毒在本氏烟植物体内复制的影响。我们利用CMV和TAV病毒基因组和亚基因组的寡聚核苷酸探针对植物叶片组织中病毒RNA进行Northemblot杂交检测。在本氏烟中，共浸润接种CMV RNA1、RNA3和TAV RNA2，在接种14天后的植物系统叶中，发现有重组体RNA3和RNA4。这说明，异源复制酶CMV1 a/TAV2a能够合成病毒基因组和亚基因组RNA，进而系统性侵染植物。经过测序确定，基因组RNA的序列中发生不同的碱基突变，重组体RNA3有完整的CMV RNA3的碱基序列，并在其3'末端融合TAV RNA2的3'非翻译区(3'untranslated region，3'UTR)序列。将重组体RNA3进行侵染性克隆构建，并与异源复制酶CMV1a/TAV2a共同瞬时表达，Northern Blot结果表明，异源复制酶能够有效的合成重组体RNA3。
　　综上所述，CMV亚基因组RNA4A的复制需要完整的CMV1a蛋白结构域的支持;而且共浸润接种CMV RNA1和RNA3与TAV RNA2，导致在基因组RNA的序列中发生不同程度的碱基突变并且产生一种重组体RNA3，并在异源复制酶CMV1a/TAV2a的调控下能够有效的复制。C1T2C3组成的病毒基因假重组体在三生烟植物中转接三次后，也能够检测到重组体RNA。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 黄瓜花叶病毒

1．1．1 黄瓜花叶病毒的分子特性与功能

1．1．2 番茄不孕病毒的分子特性和功能

1．1．3 病毒的多样性研究

1．1．4 黄瓜花叶病毒属2b蛋白的功能

1．2 病毒的复制周期

1．2．1 黄瓜花叶病毒的传播方式

1．2．2 病毒的复制过程

1．3 植物病毒重组

1．3．1 RNA病毒重组研究概括

1．3．2 CMV和TAV病毒重组研究

1．4 本研究的目的与意义

1．4．1 研究目的与意义

1．4．2 研究内容

第二章 CMV和TAV基因组假重组对病毒复制的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 农杆菌

2．1．2 常用试剂与配置

2．1．3 农杆菌浸润接种

2．1．4 RNA提取及Northern Bolt

2．2 结果与分析

2．2．1 CMV和TAV基因组假重组对病毒复制的影响

2．3 小结与讨论

第三章 1a蛋白对病毒亚基因组RNA4A合成的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 酶与试剂

3．1．2 常用试剂配制

3．1．3 CMV1a与TAV1a片段交换的1a重组体克隆构建

3．1．4 植物总蛋白提取与Western blot印迹检测

3．2 结果与分析

3．2．1 异源复制酶TAV1a／CMV2a对亚基因组RNA4A合成的影响

3．2．2 1a蛋白对病毒亚基因组RNA4A合成的影响

3．2．3 1a蛋白功能域的互换对病毒亚基因组RNA4A合成的影响

3．3 小结与讨论

第四章 CMV和TAV基因组假重组产生重组病毒RNA

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 酶与试剂

4．1．3 病毒摩擦接种

4．1．4 RT-PCR

4．1．5 重组RNA3克隆

4．2 结果与分析

4．2．1 不同的假重组对于病毒复制的影响

4．2．2 假重组病毒C1T2C3的转接对病毒基因组的影响

4．2．3 重组RNA3的克隆构建

4．2．4 异源复制酶对重组病毒RNA复制的影响

4．3 小结与讨论

总结与展望

参考文献

致谢