表面活性剂和木质纤维素对桦褐孔菌产活性多糖的作用

摘要

桦褐孔菌属于白腐真菌，同时也是一种极其珍贵的药用真菌，它发酵产生的次级代谢产物有很多种类，如三萜、多酚、桦褐孔菌醇、多糖等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等免疫活性，对心血管疾病、胃炎、肺结核和癌症等疾病有很好的治疗作用。但是野生的桦褐孔菌非常稀少，而且由于对生长环境的要求严格，人工培育技术的不成熟，使得桦褐孔菌远远不能满足市场需求。研究采用液体深层发酵技术对桦褐孔菌进行大规模培养，不仅缩短了生长周期，且能获得大量的桦褐孔菌活性成分。
　　因为真菌生长受到环境条件的限制，如氧气、pH、温度等，通过对真菌生长的培养条件进行优化，可以提高多糖的产量。我们组的前期研究表明表面活性剂Tween80、TritonⅩ-100，通过改变菌丝体细胞膜的通透性，不同程度的促进了多糖的积累。我们研究组的前期研究还发现，桦褐孔菌在液体发酵体系中能降解秸秆木质纤维素并促进多糖的产生。
　　本论文通过研究液体深层发酵桦褐孔菌对麦秆木质纤维素的降解和表面活性剂对降解的促进作用，以及两者对桦褐孔菌活性多糖产生的共同作用，旨在建立以麦秆木质纤维素为后续碳源并添加表面活性剂的桦褐孔菌发酵多糖的高产、高活性的液体深层发酵制备技术。通过分析表面活性剂作用下的麦秆木质纤维素三种成分的降解率，以及扫描电镜(SEM)观察降解后的麦秆表面结构的变化，明确了Tween80对桦褐孔菌降解麦秆木质纤维素的影响。同时，明确了麦秆木质纤维素降解和表面活性剂Tween80、TritonⅩ-100对胞内和胞外多糖的产量和抗氧化活性的共同促进作用。本论文还对胞外和胞内多糖的抗氧化活性以及构效关系进行了研究。
　　主要研究成果如下:
　　1、通过对菌丝体生物量、胞内外多糖含量以及多糖溶液的DPPH清除活性进行比较筛选，得出最佳的混合培养基，分别为Tween80+麦秆和TritonⅩ-100+麦秆组合。Tween80+麦秆混合培养基，能够同时提高胞外多糖(EPS)的产量和抗氧化活性，促进率分别是64.4％和35.8％(p＜0.05)。TritonⅩ-100与麦秆的组合，对胞内外多糖产量的提高最显著，对胞内多糖（IPS1、IPS2）和EPS的产量的促进率分别是23.2％，13.5％，79.7％(p＜0.05)。
　　2、在发酵周期12天内，对照-EPS、麦秆-EPS、麦秆+Tween80-EPS和麦秆+TritonⅩ-100-EPS的含量随着发酵天数的增长不断增加。在发酵初期，多糖产量增长迅速，发酵后期逐渐趋于平稳。不同来源的桦褐孔菌多糖都在第9天达到了最大值，混合培养基中的多糖产量比对照、麦秆培养基中的多糖的产量要高。可能原因是非离子表面活性剂Tween80、TritonⅩ-100改变了真菌细胞膜的通透性，促进对发酵液中营养物质的吸收利用，促进更多胞外多糖的积累。
　　不同培养基中的多糖对DPPH自由基的IC50值见下表，结果显示混合培养基中的多糖具有最强的抗氧化活性（最低的IC50值）。
　　表1.来自不同培养基(对照、麦秆、麦秆+Tween80)中胞外多糖的IC50值┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓┃ EPS对照麦秆麦秆+Tween80┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃IC50(mg/ml)4.81c3.24b2.21a┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃同一行中不同字母代表有显著性差异(p＜0.05)┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃表2.来自不同培养基(对照、麦秆、麦秆+TritonⅩ-100)中多糖的IC50值┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃ IC50(mg/ml)┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃EPS IPS1 IPS2┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃对照4.23b6.57c6.78c┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃麦秆2.66a4.68b4.81b┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃麦秆+TritonⅩ-1002.37a3.86a3.96a┃┗━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
　　同一行中不同字母代表有显著性差异(p＜0.05)
　　3、进一步研究了多糖的化学组成（糖、糖醛酸、多酚、蛋白质含量）和单糖组成与多糖的抗氧化活性的关系。其中，混合培养基（麦秆+Tween80）中的胞外多糖具有最高的多酚、糖醛酸、糖、蛋白质含量，分别为2.84％，7.75％，43.28％，20.53％。结果表明添加麦秆和Tween80促进了胞外多糖的各化学成分的增加。
　　4、对不同来源的桦褐孔菌胞外多糖用气相色谱(GC)分析单糖的组成。结果显示，多糖主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖和少量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖。组成麦秆+Tween80-EPS有最高含量的鼠李糖为6.5％，并且麦秆+Tween80-EPS与对照-EPS相比有更高的葡萄糖含量为35.4％。因此初步推测，鼠李糖和葡萄糖对多糖的抗氧化活性有促进作用。
　　5、为了初步了解麦秆+Tween80共同促进对桦褐孔菌多糖产量和抗氧化活性的机理，本论文研究了Tween80对桦褐孔菌液体深层发酵降解麦秆的影响。发酵结束后，麦秆木质纤维素的三种成分纤维素、木质素、半纤维素的降解率分别达到了70.20％，75.57％，76.67％，降解率得到显著提高，说明Tween80促进了桦褐孔菌降解麦秆。因此，在我们组前期明确表面活性剂和木质纤维素降解分别对桦褐孔菌多糖产生的促进作用的基础上，本论文的研究进一步明确了两者共同作用的可能机理。
　　综上所述，将表面活性剂与麦秆相结合对桦褐孔菌多糖的活性及产量促进作用显著，而且Tween80的添加，也促进了桦褐孔菌降解麦秆，其机理有待进一步研究。因此本论文对活性真菌多糖的发酵产生，以及桦褐孔菌降解利用木质纤维素的研究具有一定意义。

目录

声明

摘要

1．1．1 桦褐孔茵简介

1．1．2 桦褐孔菌的化学成分

1．1．3 桦褐孔菌的生物活性

1．1．4 桦褐孔菌液体深层发酵研究

1．2 多糖类化合物的研究现状

1．2．1 药用真菌多糖的简介

1．2．2 多糖的制备提取方法

1．2．3 多糖的分析检测方法

1．2．4 多糖的理化性质与结构

1．2．5 桦褐孔菌多糖的生物活性

1．3 木质纤维素的研究现状

1．3．1 木质纤维素的简介

1．3．2 白腐真菌对木质纤维素的降解

1．3．3 木质纤维素对真菌液体深层发酵的影响

1．4 表面活性剂的研究现状

1．4．1 表面活性剂的简介

1．4．2 表面活性剂对真菌液体深层发酵的影响

1．5 本论文的研究思路和内容简介

参考文献

第二章 原始菌种的活化与纯培养和液体深层发酵产多糖的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 原始菌种

2．2．4 实验培养基

2．3 原始菌种活化与纯培养

2．3．1 原始菌种的培养和保藏

2．3．2 菌丝、菌落和液态菌种的形态观测

2．3．3 桦褐孔菌的斜面平板扩大培养

2．3．4 桦褐孔菌液态菌种的发酵制备

2．4 桦褐孔菌液体深层发酵条件的研究

2．4．1 发酵液中pH的变化

2．4．2 发酵液中还原糖含量的变化

2．4．3 菌丝体生物量的变化

2．4．4 发酵液中胞外多糖的制备及含量变化

2．5 小结

参考文献

第三章 不同表面活性剂和麦秆对桦褐孔菌发酵产活性多糖的影响

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验培养基

3．2．4 原始菌种

3．2．5 麦秆木质纤维素的预处理

3．3 实验方法

3．3．1 菌丝体生物量的分析

3．3．2 桦褐孔菌胞内外多糖含量的分析

3．3．3 桦褐孔菌胞外多糖DPPH清除率的分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 不同表面活性剂结合麦秆对菌丝体生物量的影响

3．4．2 不同表面活性剂和麦秆共同作用对桦褐孔菌胞外多糖产量的影响

3．4．3 不同表面活性剂和麦秆共同作用对桦褐孔菌胞内多糖产量的影响

3．4．4 不同表面活性剂结合麦秆对桦褐孔菌多糖的抗氧化活性影响

3．5 小结

参考文献

第四章 Tween 80对桦褐孔菌产胞外多糖及麦秆降解的影响

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 麦秆木质纤维素的预处理

4．2．4 原始菌种

4．2．5 实验培养基

4．3 实验方法

4．3．1 液体发酵过程中麦秆木质纤维素三种成分降解率的测定

4．3．2 木质纤维素表面结构的测定

4．3．3 胞外多糖的提取制备和分离纯化

4．3．4 多糖对DPPH自由基清除率及半数抑制浓度IC50的测定

4．3．5 糖含量的测定

4．3．6 糖醛酸含量的测定

4．3．7 蛋白质含量的测定

4．3．8 多酚含量的测定

4．3．9 桦褐孔菌多糖的单糖组成分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 麦秆和Tween 80对桦褐孔菌胞外多糖的产量的影响

4．4．2 麦秆和Tween 80对桦褐孔菌胞外多糖抗氧化活性的影响

4．4．3 不同来源桦褐孔菌多糖的DPPH自由基清除率及半数抑制浓度IC50

4．4．4 麦秆和Tween 80对桦褐孔菌胞外多糖的理化性质的影响

4．4．5 不同来源桦褐孔菌胞外多糖的单糖组成分析

4．4．6 发酵过程中木质纤维素三种成分降解率随时间的变化

4．4．7 木质纤维素降解过程中表面结构的变化

4．5 小结

参考文献

第五章 TritonX-100和麦秆对桦褐孔菌发酵产活性多糖的的影响

5．1 引言

5．2 实验材料和方法

5．2．1 原始菌种

5．2．2 麦秆木质纤维素的预处理

5．2．3 培养基

5．2．4 实验仪器

5．2．5 实验试剂

5．2．6 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 TritonX-100和麦秆对胞内、胞外多糖产量的影响

5．3．2 TritonX-100和麦秆对桦褐孔菌发酵产胞内外多糖DPPH清除率的影响

5．3．3 胞内外多糖对DPPH自由基的半数抑制浓度IC50

5．4 小结

参考文献

6．1 总结

6．2 展望

致谢

硕士期间发表的论文