木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的共固定化及在手性合成中的应用

摘要

本文首先对限氮培养基在富氧环境下培养黄孢原毛平革菌同时合成木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的条件进行了研究，在此基础上研究了双酶的初步分离纯化、共固定化以及在手性合成中的应用。 本文采用限氮培养基在富氧环境下培养黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶，实验表明：葡萄糖和酒石酸铵分别为最佳碳、氮源；最佳碳源浓度为15g/L和10g/L时；最佳氮源浓度为0.2g/L和0.3g/L(分别对应于木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的合成)；最佳维生素B1、Tween-80和苯甲醇浓度分别为3mg/L、0.05％和5.0mmol/L。最佳装液量为50ml/250ml三角瓶；两天后培养基的最佳倾液量为50％，最佳通氧频率为1次/天，最佳摇床转速为80rpm，最佳接种量为3×107/瓶，最佳温度为37℃。在最优培养条件下，木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的酶活分别达到448.3U/L和27.34U/L。 采用先除多糖，再超滤浓缩，最后盐析的方法对木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶进行了初步的分离纯化。结果表明：1/3体积的冷丙酮和一次冻溶为最佳除多糖方法；超滤浓缩后的酶液在60％饱和硫酸铵浓度下的盐析效果最佳，木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶均获得最高的比酶活，分别达6042.6U/g和513.63U/g。 选取壳聚糖作载体，戊二醛作载体的活化剂对木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶进行共固定化。实验表明：采用先活化载体后共价结合酶的顺序比同时活化和共价好；戊二醛作活化剂比乙二醛好；最佳粗酶液加量为30ml/0.4g载体；最佳戊二醛浓度为0.2％；戊二醛最佳处理时间和酶的最佳固定化时间均为10h。固定化后，木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的酶活回收率分别达到了81.4％和45.2％。 应用木素过氧化物酶对两个代表性的手性物质——BINOL(轴手性)和苯甲亚砜(点手性)在水互溶有机溶剂单相体系中的催化合成进行了研究。结果表明：两产物均为R型产物；底物2-萘酚和苯甲硫醚的最佳加量分别为1.0mmol和0.4mmol；H2O2的最佳加入方式为流加方式，对于苯甲亚砜的合成最佳加量为0.4mlH2O2(0.12％)，对于BINOL的合成则为0.5mlH2O2(0.12％)；最佳的有机共溶剂为乙腈；反应温度和甲基乙二醛的添加对于两产物的ee和得率影响均较大；最佳酶形态对于合成苯甲亚砜的反应为固定化酶，对于合成BINOL的反应为游离酶。在优化的催化条件下，BINOL和苯甲亚砜的得率分别为30.1％和36.9％；ee分别为74.6％和59.8％。

目录

文摘

英文文摘

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第一章文献综述

第二章黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶及乙二醛氧化酶发酵条件的优化

第三章木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的初步分离提取

第四章木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶的共固定化研究

第五章木素过氧化物酶和乙二醛氧化酶在手性合成中的应用

第六章展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文