共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球及其在生产葡萄糖酸或其盐中的应用

摘要

本发明公开了一种共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球及其在催化氧化葡萄糖制备葡萄糖酸（盐）中的应用。本发明的共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球能有效促进载体和酶分子的共价连接，大大提高了固定化效率，并且显著延长了共固定化GOD/CAT的使用寿命，可反复使用次，生产成本低，有利于可持续发展，采用本发明的共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球制备葡萄糖酸盐收率高，反应条件温和，设备简单易得，是一种绿色环保的生产方法。

说明书

技术领域

本发明涉及葡萄糖酸或其盐的生产方法，特别是共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球及其在催化氧化葡萄糖生产葡萄糖酸或其盐中的应用。

背景技术

葡萄糖酸是葡萄糖氧化产物，经过衍生后可得到系列葡萄糖酸产品，其包括葡萄糖酸钙，葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸锰、葡萄糖酸铜、葡萄糖酸钡及葡萄糖酸内酯等产品。葡萄糖酸盐系列产品和葡萄糖酸内酯，在国内外需求量达到70－80万吨，产量不断扩大。

葡萄糖酸钙的生产方法有电解氧化法、溴化法、金属催化合成法、发酵法等。在工业化大生产中，目前主要采用金属催化法和发酵法。

电解氧化法制葡萄糖酸在国外已有工业化生产，而在国内尚处于试验阶段，2000年鲁战光等人把钌镀在钛上作为工作电极，电流效率(生成单位摩尔葡萄糖酸理论消耗电量／生成单位摩尔葡萄糖酸实际消耗电量)可达76.50％。

汪祖模及高树桐等人以均相化学氧化法，分别采用过氧化氢、次氯酸钠作为氧化剂，产率分别为70％ 和90％，实现了工业化中试。但均相化学氧化法需要严格控制催化剂在反应液中有效成分的含量，对温度、溶液pH值有依赖性，中间步骤多，副产物多，产物难于分离，且作为催化剂的盐难以再生，产率较低。反应时间较长，且对环境有较大污染。

目前我国多采用发酵法生产葡萄糖酸钙，然后用葡萄糖酸钙经过离子交换、蒸发浓缩、结晶合成葡萄糖酸。生物发酵法需要培养菌种、筛选菌种及灭菌等诸多过程，且对温度要求较为严格，副产物多，周期较长，且生产的葡萄糖酸过程中因加入菌体等杂质，影响葡萄糖酸的产品纯度，因而其发展急需解决很多技术问题。

近年来，酶制剂工业伴随着下游行业的快速发展而发展，在种类和品质上都有了很大的提高。酶法工艺就是利用酶制剂直接将葡萄糖转化成葡萄糖酸，再经过碱的中和作用，将其转化成葡萄糖酸盐系列产品。与发酵法相比，酶法最显著的特点就是不需要种子培养，免去了微生物和培养基等原辅材料对反应体系的干扰，提高了反应产物的纯度，给提取和精制带来方便。没有了种子培养，因而反应更加容易控制，生产也会变得更加平稳。对生产者而言，酶法工艺简便，设备简单、操作方便，没有染菌的危险，而且产物单一，纯度高，易于分离和精制，产品质量和收率显著提高，产品等级完全达到食品级和注射级标准。对于新建厂，可以省去种子罐和部分提取设备，降低了设备投资。与金属催化法相比，酶法还具有安全性高的特点。

将酶进行固定化，可以显著提高酶的稳定性。不易受外界环境的影响而失活。固定化酶易于与产品分离，由于反应体系中只有底物，产物，固定化酶，反应结束后将固定化酶从反应体系中分离回收，体系中只存在产物，易于进行产品的精制，产品纯度高。固定化酶可以重复进行回收利用，大大降低酶的成本。

现有的利用固定化酶法制备葡萄糖酸盐的工艺，例如《化学与生物工程》2008年第2期“海藻酸钙凝胶固定葡萄糖氧化酶的研究”一文公开的方法是：利用海藻酸钙凝胶颗粒固定葡萄糖氧化酶( GOD)，该方法操作简便易行，反应条件温和，但是该法只固定了一个酶，催化过程中产生的H₂O₂无法及时分解，加速GOD及CAT的失活；另外，固定化酶稳定性较差，重复使用次数少。又如《食品与药品》2011年第9期“固定化酶法制备葡萄糖酸钙的研究”一文公开的方法是：将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶共价固定到经戊二醛预处理的壳聚糖上，用所得固定化酶催化葡萄糖转化为葡萄糖酸钙。再如2011年9月28日公开的公开号为CN102199592的“一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法”专利，公开的方法是：以壳聚糖-精氨酸阴离子微球为载体，加入GOD和CAT混合溶液及戊二醛，经交联反应、过滤、洗涤、冷冻干燥，制备出共固定化GOD和CAT微球。该方法的优点是充分利用了精氨酸作为“柔性手臂”，实现了在“柔性手臂”上的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的共固定化，减小了固定化酶的空间位阻效应。然而，这些方法仍然存在一些缺点，比如载体微球表面积有限，无法负载过多的酶蛋白，使酶活力回收率较低。另外，由于传质阻力的影响，反应过程中生成的H₂O₂不能迅速分解，从而导致GOD和CAT失活，固定化酶在连续使用后很快便失去大部分的酶活性。本发明采用聚甲基丙烯酸类大孔树脂为固定化载体，成本低，孔径、粒径及环氧基密度均可控，研究表明，树脂的孔径、粒径等参数对酶的负载量影响非常大，因此聚甲基丙烯酸类大孔树脂可以根据具体需求最大限度的适用于GOD/CAT的固定化。本发明采用将酶蛋白聚集交联，使有限的载体表面积能负载更多的酶蛋白。另外由于载体有合适的孔径，能够克服传质阻力的影响，固定化酶扩散传质阻力很小，反应速率接近于使用游离酶。

发明内容

本发明其主要目的是提供一种克服以往固定化成本高，工艺复杂，酶活回收率低等缺点提供一种共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶（GOD/CAT）微球，本发明的微球具有酶活力回收率较高，固定化酶稳定，可重复使用等优点。另外提供一种生产过程简单、污染物少、产品纯度高、能耗低的葡萄糖酸（盐）生产方法，即固定化酶法制造葡萄糖酸（盐）。使用本发明制备的固定化酶催化生产葡萄糖酸（盐），固定化酶内部扩散传质阻力很小，反应速率接近于使用游离酶，转化率可达100%，且无副产物产生，见附图1。

为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球，其通过包括如下步骤的方法所制备而成： 

（1）以具有大孔结构PGMA微球为载体，所述的微球的平均孔径介于100-200nm之间，以1-5%（v/v）乙二胺溶液为氨基化试剂，按载体质量：氨基化试剂体积1:40将载体分散于氨基化试剂中，在pH7-9，40-80℃下振荡反应1-6h，收集氨基化载体；

（2）按照葡萄糖氧化酶：过氧化氢酶的活力比为1:1-6的比例，将GOD和CAT溶解于pH5-8的磷酸缓冲液中；在酶溶解液中加入碳二亚胺以及的N-羟基琥珀酰亚胺，0-8℃下反应15-60min，然后将氨基化载体分散于酶液中，25-35℃下搅拌反应1-10h；

（3）在步骤（2）反应液中加入1-5倍反应液体积的丙酮和0.1-2.0%（v/v）交联剂，继续反应0.5-1.5h，将上述反应液进行过滤，弃滤液，收集固形物，用磷酸缓冲液或水洗涤3-5次，干燥得到共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的交联剂选自戊二醛、香草醛等二醛类交联剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的大孔结构PGMA微球是通过如下方法得到，所述的方法包括如下步骤：用于固定化酶的树脂为大孔GMA树脂，通过悬浮聚合即可得到，通过控制致孔剂和交联剂的用量来控制微球孔径的大小，树脂微球粒径的大小通过转速来调节。优选的，将功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、交联单体二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）、三烯丙基异氰酸尿酯（TAIC）、致孔剂甲苯混合，分散相为为悬浮稳定剂聚乙烯醇（PVA）水溶液，然后使用偶氮二异丁腈（AIBN）作为引发剂进行聚合反应，生成的微球经过抽真空过滤，并用去离子水和乙醇浸洗，真空干燥。

本发明另一方面还涉及上述共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的应用，所述的应用为用于固定化酶催化氧化葡萄糖生产葡萄糖酸或其盐。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的催化氧化过程包括如下步骤：将葡萄糖溶液，成盐试剂和共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球加入带搅拌设备的反应容器中，反应温度32-40℃，pH 5.5～7.5，通风 1:0.14～0.15（v/v/h）（谁的体积比上谁的体积）；氧化时间12～20小时，残糖低于0.3%时终止反应。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤还包括在氧化反应结束后回收共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球，重复使用，优选的，共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的重复使用次数介于15-20次之间。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的成盐试剂选自碳酸钙、碳酸镁、氢氧化锌。

本发明的共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球能有效促进载体和酶分子的共价连接，大大提高了固定化效率，并且显著延长了共固定化GOD/CAT的使用寿命，可反复使用次，生产成本低，有利于可持续发展，采用本发明的共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球制备葡萄糖酸盐收率高，反应条件温和，设备简单易得，是一种绿色环保的生产方法。

附图说明

图1：酶催化法生产葡萄糖酸钙反应进程。

具体实施方式

用于固定化酶的树脂为大孔GMA树脂，通过悬浮聚合即可得到，悬浮聚合在250ml三口烧瓶中进行，树脂微球粒径的大小通过转速来调节，此处为转速500rpm。连续相由功能单体GMA（0.05mol）交联单体EDMA（0.0125mol）、TAIC（0.0125mol）、致孔剂甲苯（0.084 mol）组成。AIBN作为引发剂，其质量为三种单体质量的2%。分散相为1%悬浮稳定剂聚乙烯醇（PVA）。温度控制在75℃2h，85℃2h。反应停止后，微球经过抽真空过滤，并用去离子水和乙醇浸洗，真空干燥即得。通过控制致孔剂和交联剂的用量来控制微球孔径的大小，树脂微球粒径的大小通过转速来调节。反应停止后，微球经过抽真空过滤，并用去离子水和乙醇浸洗，真空干燥。该树脂表面含有丰富的环氧基团，而PGMA表面本身具有高反应活性的环氧基，不用经过活化就可以直接与氨基、羟基、巯基发生反应。最大的好处是可以通过控制孔径、粒径的大小来选出最适合固定化酶的合适载体。

实施例1：

一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法，具体方法步骤如下：

以2%（v/v）牛血清蛋白溶液为氨基化试剂，载体平均孔径为100-200nm，按载体质量：氨基化试剂体积1:40将载体分散于2%（v/v）氨基化试剂中，在pH8.0，60℃下200rpm振荡反应2h，收集氨基化载体。按照GOD：CAT的活力比为1:2的比例，将GOD和CAT溶解于pH6的0.5mol/l的磷酸缓冲液中。将氨基化载体分散于酶液中，30℃在搅拌转速200rpm下反应2h，在反应液中加入2倍反应液体积的丙酮和0.5%（v/v）戊二醛，继续反应1h。将上述反应液进行过滤，弃滤液，收集固形物，对于收集的固形物，用pH7.0的0.01mol/l磷酸缓冲液洗涤3次，4℃干燥，就制备出环氧树脂共固定化GOD/CAT微球，GOD酶活力为106.8U/g。

实施例2：

以2%（v/v）乙二胺溶液为氨基化试剂，载体平均孔径为100-200nm，按载体质量：氨基化试剂体积1:40将载体分散于2%（v/v）氨基化试剂中，在pH8.0，60℃下200rpm振荡反应2h，收集氨基化载体。按照GOD：CAT的活力比为1:2的比例，将GOD和CAT溶解于pH6的0.1mol/l的磷酸缓冲液中。将氨基化载体分散于酶液中，30℃在搅拌转速200rpm下反应2h，在反应液中加入2倍反应液体积的丙酮和0.5%（v/v）戊二醛，继续反应1h。将上述反应液进行过滤，弃滤液，收集固形物，对于收集的固形物，用pH7.0的0.01mol/l磷酸缓冲液洗涤3次，4℃干燥，就制备出环氧树脂共固定化GOD/CAT微球，酶活力为111.9U/g。

实施例3：

以2%（v/v）乙二胺溶液为氨基化试剂，载体平均孔径为400-500nm，按载体质量：氨基化试剂体积1:40将载体分散于2%（v/v）氨基化试剂中，在pH8.0，60℃下200rpm振荡反应2h，收集氨基化载体。按照GOD：CAT的活力比为1:2的比例，将GOD和CAT溶解于pH6的0.1mol/l的磷酸缓冲液中。将氨基化载体分散于酶液中，30℃在搅拌转速200rpm下反应2h，在反应液中加入2倍反应液体积的丙酮和0.5%（v/v）戊二醛，继续反应1h。将上述反应液进行过滤，弃滤液，收集固形物，对于收集的固形物，用pH7.0的0.01mol/l磷酸缓冲液洗涤3次，4℃干燥，就制备出环氧树脂共固定化GOD/CAT微球，酶活力为35.9U/g。

 实施例4：

以2%（v/v）乙二胺溶液为氨基化试剂，载体平均孔径为100-200nm，按载体质量：氨基化试剂体积1:40将载体分散于2%（v/v）氨基化试剂中，在pH8.0，60℃下200rpm振荡反应2h，收集氨基化载体。按照GOD：CAT的活力比为1:2的比例，将GOD和CAT溶解于pH6的0.8mol/l的磷酸缓冲液中。在酶溶解液中加入0.2%（w/v）的碳二亚胺及0.2%（w/v）的N-羟基琥珀酰亚胺，4℃反应30min。将氨基化载体分散于酶液中，30℃在搅拌转速200rpm下反应2h，在反应液中加入2倍反应液体积的丙酮和1.5%（v/v）戊二醛，继续反应1h。将上述反应液进行过滤，弃滤液，收集固形物，对于收集的固形物，用pH7.0的0.01mol/l磷酸缓冲液洗涤3次，4℃干燥，就制备出环氧树脂共固定化GOD/CAT微球，酶活力为263U/g。

 实施例5：

按照质量百分比20%配制葡萄糖溶液，在装有搅拌桨的三口瓶中，加入葡萄糖溶液，碳酸钙，酶量按照葡萄糖量的0.6%～1%加入固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，进行氧化同时进行葡萄糖酸和碳酸钙中和产生葡萄糖酸钙的反应，氧化温度32-40℃。通风 1:0.14～0.15（v/v/h）；氧化时间12～20小时， pH 5.5～7.5，残糖低于0.3%时氧化结束，氧化结束后，回收固定化酶，重复使用20批酶活力仍有80%以上。

固定化酶和游离酶相比，由于存在内外扩散，初始反应速率稍低，随着反应进行，由于使用固定化酶反应受产物或其他条件因素的影响较小，反应速率略高于使用游离酶，最终均在反应进行到15h后结束（如图1所示）。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。