灭活结核杆菌脂多糖抗原的分离纯化工艺研究

摘要

结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌,其结构中的脂多糖是目前应用比较广泛的用于生产诊断用抗体的有效抗原,其成分主要是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM),而LAM来自于脂多糖LPS。因此,本课题对结核分支杆菌脂多糖的提取、分离以及纯化工艺进行研究,从而获得较佳的LAM提取纯化工艺路线,并获得高产率、高特异性的LAM。实验结果如下:
　　 1、脂多糖的提取
　　 首先,以多糖得率为检测指标,考察了影响细胞破碎率各因素,通过单因素试验以及正交试验,并将研磨、超声破碎、乙醇回流结合,确立了最优的菌体破碎、提取方案为:破碎功率为650w,回流时间为1h,乙醇浓度为50％,破碎次数50次。提取2次。
　　 2、脱蛋白试验
　　 由于蛋白残留会影响到最终脂多糖LAM的质量,因此需要对提取物脱蛋白,实验中选用了热酚水法和Sevage法脱蛋白,通过单因素、正交试验确立了较佳的工艺,综合考虑多糖保留率及蛋白脱除率,热酚法脱蛋白效果更佳,并对其工艺进行优化,优化方案为:苯酚浓度为55%,振荡时间为1h,离心时间为30min。
　　 3、脂多糖的纯化
　　 结核杆菌经过提取分离、脱蛋白后,对得到的样液进行脱脂、过柱,用蒽酮-硫酸法跟踪洗脱液的糖浓度并收集检测酶标值(OD450)。最终测得的LAM得率为6.84mg/g。
　　 实验结果表明,通过对脂多糖提取分离纯化工艺的优化,可以对LAM的得率有很大的提升。