产叶酸菌株的筛选、生物学特性研究和发酵条件优化

摘要

本研究从土壤、菠菜和水中选择性筛选得到120株菌株,进行产叶酸菌株的定性筛选,得到了34株产叶酸的菌株,再用高效液相色谱法进行定量分析,确定6株叶酸产量相对较高的菌株,命名为Ra-1、Ra-10、Ra-18、Rb-8、Rc-6、Sc-1。通过生理生化试验,16SrDNA序列系统和发育树分析,将测得的上述序列在GenBank中进行Blast同源性搜索,结果显示菌株Ra-1、Ra-10、Ra-18、Rb-8、Rc-6与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的同源性达到了99％-100%,确定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);Sc-1与嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的同源性达到了99%-100%,确定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
　　 叶酸的检测方法很多,本实验选用了高效液相色谱和荧光检测法(高锰酸钾和双氧水),比较了这三种方法的优缺点,结果显示高效液相色谱法检测0.65μg/mL叶酸标准溶液的准确率为98.9%,高锰酸钾氧化荧光法为98%,双氧水氧化荧光法相对较低,为94.2%;考虑实验的操作性,高锰酸钾荧光检测结果与高效液相色谱法检测结果更接近,准确性和稳定性高,故实验采用高锰酸钾荧光法检测叶酸浓度。
　　 同时研究6株菌的生长动力学特性,得出各菌株最适生长温度,乳酸菌属为37℃,嗜热链球菌为30℃。将各菌株分别在最适生长的条件下培养,分别测定胞内和胞外的叶酸含量,此时胞内叶酸产量是胞外叶酸量的2倍左右,由于6株菌最佳胞内叶酸产量的时间跟胞外叶酸的最高产时间不一致,综合考虑了实验操作的可行性和降低成本,且发酵液可大量收集得到胞外叶酸,因而本实验后期主要研究了菌株胞外产叶酸的质量浓度优化。
　　 在不同的培养条件下,加入优化物质的情况下比较产叶酸能力,进行单因素试验和正交分析,同时重复试验3次,分析得出各菌种的最佳发酵产叶酸条件。结果显示,菌株Ra-1的最佳产叶酸条件是葡萄糖25g/L,柠檬酸铵4g/L,PABA0.3g/L,接种量2%,培养时间24h,初始pH6.5,叶酸产量达到了1.92μg/mL;菌株Ra-10产叶酸的最佳反应条件为:葡萄糖20g/L,柠檬酸铵4g/L,PABA0.3g/L,接种量3%(v/v),培养时间48h,初始pH6.0,叶酸产量为1.78μg/mL;菌株Ra-18产叶酸的最佳反应条件为:葡萄糖20g/L,蛋白胨3g/L,PABA0.3g/L,接种量2%(v/v),培:养时间24h,初始pH6.0,叶酸产量为1.41μg/mL;菌株Rb-8产叶酸的最佳反应条件为:蔗糖20g/L,柠檬酸铵4g/L,PABA0.5g/L,接种量3%(v/v),培养时间48h,初始pH6.5,叶酸产量为1.27gg/mL,;菌株Rc-6产叶酸的最佳反应条件为:葡萄糖25g/L,酵母粉4g/L,PABA0.3g/L,接种量3%(v/v),培养时间48h,初始pH6.5,叶酸产量为1.27μg/mL;菌株Sc-1最佳产叶酸条件是蔗糖25g/L,柠檬酸铵2g/L,PABA0.3g/L,接种量2%,培养时间48h,初始pH5.5,叶酸产量为1.31μg/mL。