产脂肪酶微生物的筛选及其在多糖水解中的应用

摘要

脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰甘油酰基水解酶，是一种酯键水解酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸。目前已发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中已表现出良好的应用前景。脂肪酶具有来源广泛，分离纯化简单和成本低廉等诸多优点，将其作为非专一性水解酶应用于几丁质的水解，将极大的降低酶法制备几丁寡糖的成本。
　　本文通过富集培养、初筛培养和复筛培养从土壤中获得6个具有明显脂肪酶活性的菌株，对酶活最高的一株进行26s rDNA ITS区扩增并测序，通过与NCBI中保存的数据进行相似性分析来进行菌种鉴定，同时构建菌株的进化树。经鉴定此菌株属于Rhizopus属中的Stolonifer种，中文名称为匍枝根霉。
　　为获得最高的脂肪酶产量，在摇瓶培养条件下，利用响应面法，对匍枝根霉发酵的培养基配方和培养条件进行优化。优化后，可溶性淀粉7.60 g/L，酵母膏22.59 g/L，K2HPO45.55 g/L，NH4Cl1.80 g/L，MgSO4·7H2O2.40 g/L，NaCl1.00 g/L，橄榄油25.00 mL/L，吐温-808.00mL/L，pH4.59，此时酶活达到最高，为1.40 U/mL，与发酵优化前(0.46U/mL)相比，酶活提高了204.35％。
　　发酵液经过离心、60％硫酸铵沉淀、透析、粗酶液浓缩、正己烷萃取、DEAE-Sepharose阴离子交换后，经SDS-PAGE电泳检测纯化后脂肪酶达到电泳纯，回收率为21.5％，纯化倍数为32，分子量约为35KD，酶活为5760U/g。以PNPP为底物，酶促反应的Km和Vmax分别为0.77mmol/L和5.39μmol/L·min。
　　将猪胰脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、NOVO435脂肪酶、扩展青霉脂肪酶和纯化后脂肪酶同时应用于几丁质的水解，结果发现猪胰脂肪酶水解效果最明显，对其水解几丁质的条件进行研究，通过考察酶量、底物浓度、温度、pH和反应时间等因素对猪胰脂肪酶水解几丁质的影响，确定反应条件为:反应体系2mL，猪胰脂肪酶0.01 g，胶体几丁质浓度5％，pH7.0，反应温度60℃。反应30h后，几丁质的水解率为6％。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 脂肪酶简介

1．1．1 脂肪酶的研究历史

1．1．2 脂肪酶的来源

1．1．3 脂肪酶的催化特性

1．1．4 脂肪酶的结构特征

1．2 脂肪酶的纯化

1．3 脂肪酶的应用

1．3．1 在油脂加工中的应用

1．3．2 在乳品工业中的应用

1．3．3 在生物柴油合成中的应用

1．3．4 在手性化合物合成中的应用

1．4 几丁质／壳聚糖的简介及降解

1．4．1 几丁质／壳聚糖的简介

1．4．2 几丁质／壳聚糖的降解

1．5 论文研究背景、意义及方法

1．5．1 论文研究背景及意义

1．5．2 研究内容及技术路线

第二章 产脂肪酶微生物的筛选及菌种鉴定

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 土样采集

2．2．2 主要试剂与仪器

2．2．3 培养基

2．3 方法

2．3．1 富集培养

2．3．2 初筛培养

2．3．3 复筛培养

2．3．4 菌种鉴定

2．3．5 脂肪酶活性测定

2．4 结果与讨论

2．4．1 筛选结果

2．4．2 菌种鉴定

2．5 小结

第三章 产脂肪酶微生物的发酵优化

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 主要试剂

3．2．2 培养基

3．3 方法

3．3．1 菌种活化和种子培养

3．3．2 响应面优化

3．4 结果与讨论

3．4．1 最适碳源的筛选

3．4．2 最适氮源的筛选

3．4．3 Plackeet-Burman实验

3．4．4 最陡爬坡实验

3．4．5 响应面分析试验设计

3．4．6 验证试验

3．5 小结

第四章 脂肪酶的纯化及酶学特性研究

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 主要试剂

4．2．2 主要仪器

4．3 方法

4．3．1 发酵液离心

4．3．2 硫酸铵盐析

4．3．3 透析

4．3．4 浓缩粗酶液

4．3．5 正己烷萃取

4．3．6 DEAE-Sepharose阴离子交换层析

4．3．7 透析

4．3．8 冷冻干燥

4．3．9 SDS-PAGE凝胶电泳

4．3．10 米氏常数的测定

4．3．11 酶活测定

4．3．12 蛋白质浓度的测定

4．3．13 对硝基苯酚标准曲线

4．4 结果与讨论

4．4．1 硫酸铵盐析

4．4．2 DEAE-Sepharose阴离子交换层析

4．4．3 SDS-PAGE凝胶电泳

4．4．4 纯化结果分析

4．4．5 米氏常数的测定

4．5 小结

第五章 脂肪酶对几丁质的水解研究

5．1 引言

5．2 材料

5．2．1 脂肪酶

5．2．2 主要试剂

5．3 方法

5．3．1 不同脂肪酶对酶促反应的影响

5．3．2 酶加量对酶促反应的影响

5．3．3 底物浓度对酶促反应的影响

5．3．4 反应温度对酶促反应的影响

5．3．5 pH对酶促反应的影响

5．3．6 反应时间对转化率的影响

5．3．7 反应体系

5．3．8 胶体几丁质制备

5．3．9 DNS配制

5．3．10 脂肪酶水解几丁质酶活测定

5．3．11 乙酰氨基葡萄糖标准曲线

5．4 结果与讨论

5．4．1 不同脂肪酶对酶促反应的影响

5．4．2 酶加量对酶促反应的影响

5．4．3 底物浓度对酶促反应的影响

5．4．4 温度对酶促反应的影响

5．4．5 pH对酶促反应的影响

5．4．6 反应时间对转化率的影响

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．2 展望

参考文献

致谢

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