立体选择性羰基还原酶的筛选及其在手性药物中间体合成中的应用

摘要

手性醇含有一个活泼的羟基官能团，是大量重要手性药物的手性合成砌块。手性醇合成技术的改良对手性药物的发展起到了推动作用。因此，催化潜手性羰基化合物不对称还原生成手性醇的研究具有非常重要的理论意义和应用价值。本论文从立体选择性羰基还原酶的筛选入手，通过基因挖掘手段获取目标羰基还原酶，并对其进行底物特异性和催化性能研究，进一步应用于手性药物中间体的合成中，实现高活性高选择性催化潜手性羰基化合物不对称还原合成手性醇。主要内容如下：
　　第一部分，立体选择性羰基还原酶的筛选。通过羰基还原酶产生菌的筛选，从土壤和实验室保藏菌株中筛选到两株具有高羰基还原酶活性的新菌株：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli ZJB12126和圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides ZJB2014212。利用基因组狩猎以及数据库挖掘技术，获得48个目标羰基还原酶，构成羰基还原酶工具盒。对工具盒中的重组羰基还原酶进行底物特异性研究，最终获得3个具有较高催化活性和立体选择性以及较广底物谱的羰基还原酶新酶源：BgADH2、BgADH3和RtSCR9。
　　第二部分，重组羰基还原酶的催化性能研究。对以上3个羰基还原酶进行了分离纯化和表征，BgADH2、BgADH3和RtSCR9分子量分别为114.2kDa（四聚体）、63.4kDa（二聚体）和123.7kDa（四聚体）；优化后的pH分别为6.5、6.5和7.0；优化后的温度分别为35℃、40℃和35℃；35℃下半衰期分别为17h、85h和113h；对应的失活活化能分别为1.27kJ/mol、10.6kJ/mol和14.6kJ/mol；少数金属离子对酶活有促进作用，但EDTA对酶活影响不大，表明三种酶均属于金属非依赖型羰基还原酶。BgADH2和RtSCR9对辅酶NADPH的Km比辅酶NADH低20-200倍，属于辅酶NADPH依赖型；而BgADH3对辅酶NADPH的Km略低于NADH，为NADPH偏好型。
　　第三部分，BgADH2催化合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯（MBHB）。建立底物2-苯甲酰氨甲基-3-酮-丁酸甲酯（BMOB）和产物高效液相色谱分析方法，利用手性柱Chiralpak AY-H成功将底物产物6种异构体分离，确定其出峰顺序和保留时间。结合葡萄糖脱氢酶/葡萄糖偶联的辅酶再生体系，选择水-甲苯两相体系，pH6.5，35℃下催化60mM底物BMOB，8h后产物浓度为55.1mM，产率91.1％，ee达99.0%，de达98.5%，高于文献报道。进一步对其反应机理和催化机制进行探讨，该反应是一个动态动力学拆分（DYKAT）过程。酶的催化过程通过H的传递实现，底物C=O氧与Try151和Ser138形成氢键，从Try151-OH中夺得一个H，辅酶烟酰胺环C4上的H传递给底物C=O碳。
　　第四部分，BgADH3催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。构建羰基还原酶/葡萄糖脱氢酶双酶共表达体系E.coli/BgADH3-GDH，优化后表达条件：IPTG0.5mM、诱导温度28 oC和诱导时间12h。BgADH3酶产量达55.8U/g湿菌体，GDH酶产量66.5U/g湿菌体。发酵培养后OD600最高达36.6，BgADH3体积酶活达2347.1U/L，GDH体积酶活达2874.2U/L。考察了有机溶剂对共表达菌催化反应的影响，选择水-正辛醇两相体系，优化后底物浓度1200mM，反应6h，底物完全转化，ee达99.9%。进一步将反应放大至1L反应体系，采取底物分批补料的策略，20h内完全转化2400mM底物，产率91.8%，ee达99.9%。
　　第五部分，重组羰基还原酶RtSCR9介入的化学-酶法制备(S)-度洛西汀。合成5种度洛西汀中间体噻吩环酮类底物N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐2a、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺盐酸盐2b、3-氯-1-(2-噻吩基)-丙酮2c、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯2d、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈2e以及相应的外消旋醇3a-3e。经过筛选，RtSCR9对这些化合物均具有较高的催化活力和选择性（>99%）。构建羰基还原酶/葡萄糖脱氢酶共表达体系E.coli/RtSCR9-GDH，并应用于催化不对称还原底物2a生成产物(S)-3a。优化后葡萄糖添加量6mmol/(mmol2a)、辅酶添加量0.75μmol/(mmol2a)、温度30 oC、pH6.5、菌体量10g DCW/L和底物浓度1000mM。将反应放大至百克级规模制备(S)-3a，产率92%，ee达99.9%，时空产率达22.9mmol/(L·h·g DCW)。从乙酰噻吩出发，成功构建化学-酶法(S)-度洛西汀合成路线，整条路线由原来的6步反应缩短为4步，总收率达60.2%，ee>98.5%。

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缩略词表

第一章 绪论

1.1 手性药物概述

1.2 立体选择性羰基还原酶的概况

1.3 羰基还原酶在合成手性药物中间体中的应用

1.4 立题依据、研究意义及主要研究内容

第二章 立体选择性羰基还原酶的筛选

2.1引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 重组羰基还原酶的催化性能研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 BgADH2催化合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章BgADH3催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 RtSCR9介入的化学-酶法制备(S)-度洛西汀

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.3 结果与讨论

6.4 本章小结

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

附录

攻读博士期间撰写的论文和专利

致谢