水杨酸对粉葛愈伤组织黄酮含量及抗氧化活性影响

摘要

目前，影响药用植物细胞生产次生代谢产物技术的产业化应用的限制因素，主要有两点：一是药用植物细胞生长缓慢，生物量低；二是培养细胞的次生产物合成的产量很低。研究如何提高药用植物细胞次生代谢产物的产量对解决植物培养细胞次生物质的低产问题具有重要理论和实际指导意义。
　　 粉葛，Pueraria thomsonii Benth，富含葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物，在我国及其他东亚国家广泛用作医药业、食品业和轻工业原料。本试验以粉葛愈伤组织为材料，研究了水杨酸诱导子对粉葛细胞生长、次生代谢产物含量及粉葛提取物的抗氧化活性的影响，为粉葛细胞工程生产葛根素等异黄酮类化合物奠定了基础。研究的主要内容和结果如下：
　　 (1)培养条件对粉葛愈伤组织生长及总黄酮含量的影响
　　 为获得稳定且最优的细胞生长和产黄酮类次生产物量较高的培养条件，对培养基组成成分(细胞分裂素和生长素)、pH值、蔗糖浓度、培养温度和接种量等条件进行优化，得到了粉葛愈伤组织细胞最适的培养条件：培养基为MS+1.5×10-5M2,4-D+2×10-6M BA,30g/L蔗糖，pH5.8，培养温度25℃，7.5g/L琼脂、接种量为3g/50mL。且粉葛愈伤组织细胞生长周期为30d。由粉葛愈伤组织建立的细胞系生长呈“S”型曲线，最适继代周期为16d。
　　 (2)水杨酸对粉葛愈伤组织生长及黄酮含量的影响
　　 以水杨酸为诱导子添加到粉葛愈伤组织中，研究水杨酸的不同添加时间、添加浓度和诱导时间对培养物生长和黄酮含量的影响，最后得出水杨酸的诱导以培养第13d加入，添加浓度为2μmol/L，诱导3h效果最为明显，黄酮含量达到5.336mg/g，较对照组提高了41％。
　　 在单因素实验基础上，采用响应面分析法的Box-Benhnken实验设计，设计了3因素3水平的响应面。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出最佳工艺条件为：添加时间13.11d、诱导浓度1.76μmol/L、诱导时间3.09h，此时诱导后黄酮含量的理论值为5.42mg/g。
　　 研究了粉葛愈伤组织中黄酮类化合物的超声波提取条件。结果表明，提取粉葛黄酮的最佳提取工艺为超声时间40min、乙醇浓度75％、料液比1:20、超声温度60℃、超声功率为100W、浸提次数为2次。经测定粉葛总黄酮含量为7.146mg/g。
　　 在乙醇浓度和超声时间的单因素试验的基础上，利用响应面分析法的中心组合设计，优化粉葛愈伤组织中黄酮化合物的超声提取条件乙醇浓度和超声时间对黄酮得率的影响。用Design-Expert进行结果分析，响应面的典型分析可知稳定点是最大值，决定系数为0.9455。黄酮最佳超声提取工艺条件为：乙醇浓度74.6％，超声提取时间44min,料液比1:20，超声提取温度60℃，浸提次数2次，在此条件下黄酮含量为7.33mg/g。
　　 (4)粉葛愈伤组织提取物抗氧化活性的研究
　　 采用DPPH体系、羟基自由基体系、超氧阴离子自由基体系对经SA(水杨酸)诱导的粉葛提取物的抗氧化活性进行研究，并同BHT的抗氧化活性进行了比较。结果表明：提取物对三种自由基均有清除作用，在配制的不同质量浓度的粉葛提取物溶液中，在一定的浓度范围内，粉葛提取物对DPPH自由基、超氧自由基O2-．和羟基自由基·OH清除率随着浓度的升高呈上升趋势，在一定浓度下，经SA诱导后粉葛提取物对DPPH、O2-·、·OH的清除率最高分别是90.63％、62.68％、71.88％，分别比相同浓度下对照组提高了24.54％、13.1％、28.7％。在一定使用量的条件下其抗氧化效果优于BHT。粉葛粗提物具有良好的抗氧化性能，表明粉葛黄酮是一种天然有效的自由基清除剂。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 植物次生代谢物的细胞培养技术研究进展

1.1.1 外植体选择

1.1.2 高产细胞系的选择

1.1.3 物理因素

1.1.4 化学因素

1.1.5 培养方法

1.2 植物黄酮类研究进展

1.2.1 黄酮类化合物概述

1.2.2 黄酮类化合物提取工艺

1.2.3 黄酮类化合物抗氧化研究进展

1.3 粉葛研究现状

1.3.1 粉葛分布及化学成分

1.3.2 葛的药理学作用研究

1.3.3 葛根的开发利用现状

1.4 诱导剂在植物细胞培养中应用的概况

1.4.1 诱导子的定义与种类

1.4.2 诱导子的作用效果

1.4.3 诱导子之间的互相作用

1.5 目的意义及主要研究内容

1.5.1 研究目的和意义

1.5.2 研究内容

第二章 粉葛愈伤组织细胞培养条件的优化

2.1 前言

2.2 材料、试剂和实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 细胞生长量、细胞干重的测定

2.3.2 黄酮类次生产物含量的测定

2.3.3 粉葛愈伤组织培养条件优化

2.3.4 高产细胞系的筛选与细胞生长周期的确定

2.4 实验结果

2.4.1 粉葛细胞中黄酮类次生产物含量的测定

2.4.2 粉葛愈伤组织细胞系培养条件的优化

2.4.3 愈伤组织细胞生长周期的确定

2.5 小结

第三章 水杨酸对愈伤组织次生代谢产物合成影响

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂和仪器

3.3 实验方法

3.3.1 水杨酸诱导剂准备

3.3.2 水杨酸加入时间的筛选

3.3.3 水杨酸添加浓度的筛选

3.3.4 水杨酸诱导时间的筛选

3.4 实验结果和分析

3.4.1 添加时间对粉葛细胞生长及黄酮含量影响

3.4.2 诱导浓度对粉葛细胞生长及黄酮含量影响

3.4.3 诱导时间对粉葛细胞生长及黄酮含量影响

3.4.4 响应面法优化诱导子对粉葛细胞黄酮类含量的影响

3.5 小结

第四章 粉葛愈伤组织提取物抗氧化活性研究

4.1 引言

4.2 实验材料、试剂和仪器

4.3 实验方法

4.3.1 响应面法对超声提取黄酮工艺提取条件进行优化

4.3.2 粉葛愈伤组织提取物抗氧化性研究

4.4 实验结果和分析

4.4.1 超声提取单因素对黄酮含量的影响

4.4.2 响应面法超声提取粉葛黄酮工艺条件优化

4.4.3 SA诱导粉葛后乙醇提取物抗氧化活性性研究

4.5 小结

第五章 结论及展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

致谢