海带岩藻多糖硫酸酯的分离纯化及相关活性研究

摘要

本论文通过水提法从海带中提取海带多糖,然后通过响应面法得到最佳提取条件。首先,在单因素实验的基础上,得出提取pH、提取温度、提取时间、料液比四个因素的最佳值,然后根据Centralcomposite响应面实验设计原理进一步优化提取条件,得出最佳提取条件为:提取pH3.42、提取温度83℃、提取时间3.95 h、料液比1:23,在最优条件下,实际测得的多糖得率为1.259％,与理论预测值相符。
　　 在除蛋白的过程中,我们采用2种方法对海带多糖进行了脱蛋白研究,并比较了脱蛋白效果与多糖损失之间的关系。结果表明:Sevage沉淀法要好于三氯乙酸法。在纯化过程中,我们采用高速逆流色谱法和DEAE-Sepharose Fast Flow法对海带多糖进行分离。在溶剂系统为PEG1000:K2HPO4:KH2PO4:H2O=0.5:1.25:1.25:7(w/w)、转速600r/min、流速2.0 mL/min、上样量1 g的条件下通过高速逆流色谱将海带多糖成功的分为KPS.1和KPS-2两个组分。然后,再通过DEAE-Sepharose F.F法将KPS-2分离为KPS-2-1,KPS-2-2,KPS-2-3三个组分。液相检测结果表明,KPS-2-1为纯度较高的海带岩藻多糖硫酸酯。
　　 在纯化得到纯度较高的海带岩藻多糖硫酸酯的基础上,对海带岩藻多糖硫酸酯的理化性质和抗氧化活性进行了研究。结果表明:海带多糖较难溶于冷水,可溶于热水、稀酸、稀碱,不溶于氯仿、乙醇丙酮、乙醚等有机溶剂中。1％的海带多糖溶液溶液的pH为3.48。
　　 本论文对海带岩藻多糖硫酸酯的抗氧化活性进行了研究。比较了海带岩藻多糖硫酸酯和BHT、Vc对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用。研究发现,海带岩藻多糖硫酸酯对上述三种自由基有较强的清除作用,当海带岩藻多糖硫酸酯的浓度分别达到1:mg/mL、1.6 mg/mL、0.8 mg/mL时,对三种自由基的清除率分别达到23.83％,90.84％,99.26％。体现了较好的清除自由基的能力。
　　 以酪氨酸为底物,研究了不同浓度的海带岩藻多糖硫酸酯(0.2到1.0 mg/mL)对L-酪氨酸酶的抑制作用。随着海带岩藻多糖硫酸酯浓度的增加,酪氨酸酶的活性急剧下降。当抑制剂浓度达到1 mg/mL时,抑制率达到62.21％。IC50值为0.82 mg/mL。通过测定在不同的抑制剂浓度和不同的酶液浓度的条件下的酶活力,可以得出一系列的直线,且每条直线都通过原点。随着抑制剂浓度的逐渐增加,直线的斜率逐渐下降,表明海带岩藻多糖硫酸酯对酪氨酸酶的抑制是可逆的。最后研究了海带岩藻多糖硫酸酯对酪氨酸酶的抑制动力学。在不同的底物浓度和抑制剂浓度的条件下,通过Michaelis-Menten双倒数作图法求出抑制剂的Km和Vm。随着抑制剂浓度的增加,Km增加、Vm保持不变。由此可以得出海带岩藻多糖硫酸酯对酪氨酸酶的抑制为竞争性抑制。其KI值为0.9907 mg/mL。