臭氧对副溶血性弧菌灭活机制的探索研究

摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为我国细菌性食物中毒的首要病原菌，常附着于海产品表面，人食用被污染的食品后可能会引发急性肠胃炎，患者常出现腹痛、恶心、呕吐等症状，重症者甚至可能死亡。臭氧是一种高效清洁的化学杀菌剂，它在食品加工过程中的应用已有许多研究，但其对副溶血性弧菌的影响尚未见报道。
　　本文以副溶血性弧菌为研究对象，从细胞生物学角度分析臭氧胁迫下副溶血性弧菌细胞壁膜、胞内大分子物质以及遗传物质等的变化，进而采用RNA-Seq技术对不同浓度臭氧胁迫下副溶血性弧菌的转录组进行研究，对其中具有差异表达基因的功能进行注释并比较分析，旨在探索臭氧的杀菌机制。
　　本文的主要研究结果如下:
　　1.臭氧对于副溶血性弧菌是一种高效的灭菌剂，浓度为1.2 mg/L的臭氧水处理1 min即可100％杀灭108 cfu/mL的副溶血性弧菌。响应面实验结果显示臭氧浓度、作用时间对灭菌效果影响显著(P＜0.05)，且臭氧浓度的影响为极显著(P＜0.01)。
　　2.在1.2 mg/L臭氧胁迫1min后，副溶血性弧菌细胞膜上的Na+/K+-ATP酶和及胞内的活性氧清除酶活性明显下降，DNA和RNA也已发生降解，推测臭氧胁迫下的细胞膜通透性的变化和抗氧化酶活性丧失后强氧化产物的堆积以及细菌遗传物质不可逆的损伤是导致副溶血性弧菌死亡的主要原因。
　　3.对不同浓度臭氧胁迫下的副溶血性弧菌差异表达基因进行COG功能聚类分析和WEGO功能注释，推测在低浓度(0.1 mg/L)臭氧胁迫时，副溶血性弧菌主要通过提高转录水平、促进化合物的新陈代谢等方式来增强其对臭氧的防御;但在高浓度的臭氧胁迫条件下(1.0 mg/L)，离子、氨基酸转运及防御相关基因的表达水平下降使其防御机制受到抑制，最终导致副溶血性弧菌的死亡。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 前言

1．2 副溶血性弧菌研究进展

1．2．1 副溶血性弧菌的生物学特征

1．2．2 副溶血性弧菌的分型

1．2．3 副溶血性弧菌的毒力因子和致病机理

1．2．4 副溶血性弧菌的流行状况

1．3 食源性致病菌杀菌技术

1．3．1 化学杀菌技术

1．3．2 物理杀菌技术

1．3．3 生物杀菌技术

1．4 臭氧杀菌技术的研究进展

1．4．1 臭氧的物理化学性质

1．4．2 臭氧的反应活性

1．4．3 臭氧的灭菌效果

1．4．4 臭氧杀菌的动力学参数及原理

1．4．5 臭氧浓度的检测方法

1．4．6 臭氧灭菌技术在食品加工业中的应用

1．4．7 臭氧与其他化学杀菌剂的比较

1．4．8 臭氧的安全性和毒性

1．5 转录组的研究

1．5．1 研究方法

1．5．2 RNA-Seq技术的应用

1．6 立题的背景及意义

第二章 臭氧反应条件的控制

2．1 前言

2．2 实验材料与设备

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验设备

2．3 实验方法

2．3．1 菌种处理

2．3．2 臭氧水稳定性实验

2．3．3 中和剂实验

2．4 结果与分析

2．4．1 臭氧在水中的降解趋势

2．4．2 中和剂选择

2．4 本章总结

第三章 臭氧灭菌率的影响因素分析

3．1 前言

3．2 实验材料与设备

3．3 实验方法

3．3．1 不同处理条件下灭活副溶血性弧菌

3．3．2 响应面分析影响臭氧灭菌率的关键因素

3．4 结果与分析

3．4．1 不同处理条件下臭氧灭活副溶血性弧菌的效果

3．4．2 影响臭氧灭菌率的关键因素分析

3．5 本章总结

第四章 细胞生物学分析

4．1 前言

4．2 实验材料与设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验设备

4．3 实验方法

4．3．1 副溶血性弧菌的细胞膜Na+／K+-ATP酶活性测定

4．3．2 副溶血性弧菌的细胞膜通透性测定

4．3．3 细胞表面zeta电位的测定

4．3．4 副溶血性弧菌的透射电镜观察

4．3．5 细胞内酶活性测定

4．3．6 细菌总DNA、RNA提取及凝胶电泳检测

4．4 结果与分析

4．4．1 臭氧导致副溶血性弧菌细胞内的能量亏损

4．4．2 臭氧对副溶血性弧菌细胞膜通透性的破坏

4．4．3 臭氧对副溶血性弧菌细胞表面电位的影响

4．4．4 臭氧对副溶血性弧菌细胞壁膜的破坏

4．4．5 臭氧抑制副溶皿性弧菌细胞内活性氧清除酶的活性

4．4．6 臭氧破坏副溶血性弧菌的遗传物质

4．5 本章总结

第五章 转录组学分析

5．1 前言

5．2 实验材料与设备

5．2．2 实验设备

5．3 实验方法

5．3．1 副溶血性弧菌的臭氧胁迫处理

5．3．2 RNA提取及纯化

5．3．3 RNA样品质量检测

5．3．4 RNA-Seq测序文库制备

5．3．5 RNA-Seq文库测序

5．3．6 Reads质量分析

5．3．7 转录组数据分析

5．4 结果与分析

5．4．1 RNA样品质量符合RNA-Seq测序要求

5．4．2 reads质量满足转录组分析

5．4．3 不同浓度臭氧胁迫下副溶血性弧菌产生不同的应答响应

5．5 本章总结

第六章 总结、创新点与展望

6．1 总结

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录 研究生期间发表的论文

致谢

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