水产品源创伤弧菌的毒性及超高压处理对其细胞超微结构和毒性的影响

摘要

本文通过溶血实验和小鼠急性毒性实验，评价市售水产品中创伤弧菌和创伤弧菌CICC21615菌株(V.vulnificus CICC21615)毒性大小。从市售水产品中分离获得的6株疑似创伤弧菌菌株经生化鉴定和溶细胞素基因扩增、基因测序后证实除2号分离菌株基因测序未测出外，其它5株确定为创伤弧菌。V.vulnificus CICC21615扩增出400 bp左右的基因条带，而6株分离株均扩增出222 bp左右的典型创伤弧菌溶细胞素基因条带。在溶血实验中，V.vulnificus CICC21615的溶血圈与菌落直径之比达到3.0，1-6号分离株分别为2.3、2.0、2.8、2.0、2.5和2.1。在小鼠急性毒性实验中，V.vulnificus CICC21615的半致死量(LD50)是3.776×107CFU/mL;而3号分离株的LD50为2.218×108CFU/mL。结果表明V.vulnificus CICC21615菌株毒性较3号分离株略强;3号菌株命名为V.vulnificus cd03。
　　研究了市售水产品中分离获得的V.vulnificus cd03与V.vulnificusCICC21615毒性大小和小鼠脏器毒性反应差异。两菌株分别稀释到106 CFU/mL、107 CFU/mL和108 CFU/mL，按照0.02 mL菌液/g体重给小鼠腹腔注射。小鼠腹腔注射24 h后，V.vulnificus CICC21615与V.vulnificus cd03108 CFU/mL剂量组肝脏系数分别达到了7.30％和7.27％，分别高于同菌株107 CFU/mL、106 CFU/mL剂量组和对照组，差异显著。两株创伤弧菌108 CFU/mL剂量组的小鼠肝脏细胞空泡变性明显，内部结构被破坏，细胞膜破裂。脾脏组织在108 CFU/mL剂量组中细胞间隙增大，出现大量白色斑点，脾脏组织疏松明显。V.vulnificus CICC21615与V.vulnificus cd03108 CFU/mL剂量组谷草(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)酶活增加量、谷胱甘肽s-转移酶(GST)酶活减少量分别最高达到16.62与11.62、5.77与5.6、46.25与37.29，差异显著，所有剂量组丙二醛(MDA)含量变化不显著。感染小鼠体内，创伤弧菌主要分布在肝脏和脾脏，少量分布在肾脏，血液中未分离出单菌落。试验结果表明，V.vulnificus CICC21615的脏器毒性要强于V.vulnificus cd03。菌液对小鼠肝脏和脾脏的损伤程度随着菌液浓度的增加而加重，并且高浓度的菌液既能加速小鼠肝脏组织的损伤程度，同时也提高了细胞自身修复的速度，可能原因在于激活并加快了细胞内部相关损伤修复反应。
　　本文通过超高压处理实验，研究了超高压对水产品中创伤弧菌细胞超微结构与毒性的影响。创伤弧菌标准菌株(V.vulnificusulnificusCICC21615)和分离自水产品中的创伤弧菌（V.vulnificusulnificus Cd03)经100、150、200、250、300 MPa压力处理进行菌存活数计数、透射电镜观察、260 nm与280nm紫外吸收物测定、溶血试验和小鼠急性毒性实验，未处理组作为对照组。V.vulnificusulnificus CICC21615在200 MPa压力处理下，只存活5个，致死率接近100％，250 MPa及以上致死率100％，V.vulnificusulnificus Cd03在200 MPa及以上压力处理致死率为100％。对照组的创伤弧菌细胞壁结构完整，胞浆分布均匀有序。随着压力的升高，细胞壁皱缩明显，同时细胞膜有明显的损伤且局部破裂，内含物泄漏、出现较大面积的透电子区。200 MPa及以上压力处理的菌株，细胞膜消失，细胞拟核聚合，细菌细胞蛋白凝聚。在260 nm紫外吸收中，V.vulnificusulnificus CICC21615和V.vulnificusulnificus Cd03分别在250 MPa和200MPa达到最高点，分别达到0.105和0.119;而在280nm紫外吸收中，V.vulnificusulnificusCICC21615和V.vulnificusulnificus Cd03均在250MPa达到最高点，分别达到0.106和0.187。随着压力的升高，V.vulnificusulnificus CICC21615和V.vulnificusulnificus Cd03的溶血活性和急性毒性不断减小，两者溶血活性在200MPa及以上降为0，两者急性毒性在150MPa及其以上均对小鼠无致死作用。V.vulnificusulnificus Cd03在较低压力(200 MPa)处理下，致死率就能达到100％，超高压致死细菌的原因与细胞膜的损伤有关，也与核酸与蛋白质的泄漏有关，同时拟核聚合与活性蛋白聚合也是重要的致死原因。实验研究还发现，随着压力的升高，菌株溶血活性与急性毒性均显著性下降，其直接原因与不同压力处理下的活菌数有关。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 创伤弧菌的研究现状

1．1．1 创伤弧菌的生理生化特性

1．1．2 创伤弧菌的致病性

1．2 食品杀菌方法概述

1．2．1 物理杀菌

1．2．2 化学杀菌

1．2．3 生物杀菌

1．3 本文的研究内容和意义

1．3．1 研究内容

1．3．2 研究意义

第2章 水产品中创伤弧菌的分离、鉴定及毒性的研究

2．1 前言

2．2 材料与仪器

2．2．1 菌种与试剂

2．2．2 仪器与设备

2．3 试验方法

2．3．1 样品的取样及处理

2．3．2 分离

2．3．3 活化培养

2．3．4 生化鉴定

2．3．5 DNA的提取

2．3．6 PCR-DGGE电泳

2．3．7 基因测序

2．3．8 溶血试验

2．3．9 小鼠急性毒性试验

2．4 结果与讨论

2．4．1 菌种生化鉴定

2．4．2 菌种的PCR鉴定与基因测序

2．4．3 溶血试验

2．4．4 小鼠急性毒性试验

2．5 本章小结

第3章 水产品中创伤弧菌对小鼠脏器的损伤和体内感染部位的研究

3．1 前言

3．2 材料与仪器

3．2．1 菌种与材料

3．2．2 仪器与设备

3．3 试验方法

3．3．1 小鼠急性毒性实验

3．3．2 小鼠脏器系数的测定

3．3．3 小鼠脏器内部穿刺试验

3．3．4 小鼠肝脏与脾脏组织切片HE染色观察试验

3．3．5 小鼠肝脏生化指标的测定

3．3．6 数据分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 小鼠脏器系数的测定

3．4．2 小鼠体内感染部位的测定

3．4．3 小鼠肝脏与脾脏组织损伤观察

3．4．4 小鼠肝脏生化指标的测定

3．5 本章小结

第4章 超高压处理对水产品中创伤弧菌细胞超微结构和毒性的影响

4．1 前言

4．2 材料与仪器

4．2．1 菌种与材料

4．2．2 仪器与设备

4．3．1 菌悬液的制备

4．3．2 超高压处理

4．3．3 微生物计数

4．3．4 溶血实验

4．3．5 小鼠急性毒性试验

4．4 结果与讨论

4．4．1 超高压处理对V．vulnificusulnificus CICC 21615和V．vulnificusulnificus Cd 03存活的影响

4．4．2 超高压处理对V．vulnificusulnificus CICC 21615和V．vulnificusulnificus Cd 03细胞超微结构的影响

4．4．3 超高压处理对V．vulnificusulnificus CICC 21615和V．vulnificusulnificus Cd 03细胞内紫外吸收物质泄漏量的影响

4．4．4 超高压处理对V．vulnificusulnificus CICC 21615和V．vulnificusulnificus Cd 03溶血活性的影响

4．4．5 超高压处理对V．vulnificusulnificus CICC 21615和V．vulnificusulnificus Cd 03小鼠急性毒性的影响

4．5 本章小结

第5章 结论、创新点与展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢

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