基于HepG2细胞的食品添加剂联合作用及机理研究

摘要

食品添加剂广泛应用在食品生产加工的各个环节中，而作为一类天然或合成的化合物，其安全性也一直被人们普遍关注。国家食品添加剂使用标准GB2760-2014核准使用的食品添加剂都是经过了系统毒理学安全性分析和危害风险评估才被允许使用的，按规定标准使用量添加即能保障食品安全。目前，国家食品添加剂安全评估标准是基于单一食品添加剂的毒性效应建立起来的，而现实生活中一种食品常常包含两种及以上食品添加剂联合使用，且人们每天摄入的食品种类繁多，单一食品添加剂在规定的使用范围内是安全的，而多种食品添加剂同时使用时可能产生相加、协同、拮抗等联合作用，这就对传统食品毒理学理论及食品添加剂的危害风险评估提出了新的挑战。
　　本论文采用HepG2细胞株，使用CCK-8法检测通常在食品中大量使用的防腐剂亚硫酸钠、焦亚硫酸钠及偶氮类人工合成色素日落黄、诱惑红、柠檬黄、赤藓红、胭脂红对细胞增殖活力的影响，从中选出对细胞抑制能力较大的日落黄及亚硫酸钠进行后续联合试验的研究;然后用CCK-8法及2×2析因设计方差分析模型对细胞增殖活力指标进行联合评价，高内涵分析(HCA)技术按效应相加模型进行单独及联合作用的多参数细胞毒性（细胞数量、膜通透性、活性氧释放量、死活比率、DNA损伤）研究;同时选取防腐剂山梨酸钾及抗氧化剂D-异抗坏血酸钠进行平行验证试验。
　　接着运用HCA对日落黄与亚硫酸钠、山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠单独及联合作用的多参数细胞凋亡指标（Caspase-3/7、钙离子浓度、线粒体膜电位）和细胞周期进行研究，对其诱发的凋亡机制进行初步分析。
　　最后运用实时荧光定量PCR和Western印迹法对日落黄与亚硫酸钠、山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠单独及联合作用后细胞的Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53、Caspase-12基因与蛋白的表达量进行分析进一步确定凋亡的通路。
　　通过上述试验对食品添加剂单独及联合作用的相关生物学指标进行分析，研究其联合作用方式，并对作用机理进行探索;为食品添加剂的使用标准制定提供参考依据，主要结果及结论如下:
　　几种食品添加剂单独作用均呈剂量相关性的抑制HepG2细胞增殖，抑制能力大小为:亚硫酸钠＞焦亚硫酸钠，日落黄＞胭脂红＞柠檬黄＞诱惑红＞赤藓红，其中亚硫酸钠及日落黄作用24 h的IC50大小分别为1.06±0.07 g/L和0.30±0.02 g/L;山梨酸钾及D-异抗坏血酸钠均呈时间及剂量正相关抑制增殖，其24 h的IC50大小分别为1.35±0.11 g/L和1.58±0.17 g/L，按照析因方差设计分析联合作用类型表现为协同作用。
　　日落黄与亚硫酸钠、山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠单独及联合使用均会显著减少细胞数量，并且增加细胞膜通透性、死活比率及活性氧的释放量，均表现出剂量相关性;与单独组相比，按照效应相加模型评价均表现为协同作用。低、中剂量的处理组均未发现DNA损伤现象。
　　日落黄与亚硫酸钠、山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠单独及联合使用会导致HepG2细胞中Caspase-3/7蛋白及钙离子浓度显著上升，线粒体膜电位显著下降，三种指标均呈现剂量相关性，联合作用类型表现为协同;并且还发现这几种化合物都诱导HepG2细胞发生了细胞周期阻滞，不同剂量诱导产生不同的周期阻滞，单独组主要将周期阻滞在G0/G1和S期;联合组则表现为G0/G1期阻滞。
　　实时荧光定量PCR和Western印迹法检测结果显示日落黄与亚硫酸钠、山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠单独及联合使用时均可通过显著提高Caspase-3、Bax、P53基因的表达，同时显著降低Bcl-2的表达来诱导凋亡的发生;而Caspase-12基因无明显的变化。
　　上述实验表明日落黄与亚硫酸钠、山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠单独及联合作用均会对HepG2细胞产生多参数细胞毒性，并诱导细胞凋亡，且高剂量使用具有一定的遗传毒性。综上所述，日落黄、亚硫酸钠与山梨酸钾、D-异抗坏血酸钠联合作用于HepG2细胞时均表现为协同作用;主要通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 食品添加剂的使用及研究现状

1．2 常用食品添加剂概述

1．2．1 合成色素

1．2．2 防腐剂和抗氧化剂

1．3 食品添加剂检测技术的发展

1．4 联合作用的分类及评价方法

1．4．1 联合作用的分类

1．4．2 联合作用的评价方法

1．5 细胞毒性概述

1．5．1 细胞坏死

1．5．2 细胞凋亡

1．6 立题背景及意义

第2章 食品添加剂单独及联合作用对HepG2细胞多参数毒性的影响

2．1 引言

2．1．1 CCK-8法简介

2．1．2 高内涵分析技术简介

2．2 材料及仪器

2．2．1 主要实验材料与试剂

2．2．2 实验仪器与设备

2．2．3 实验试剂的配置

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养常规操作

2．3．2 CCK-8法检测细胞增殖活力

2．3．3 食品添加剂单独及联合作用的多指标细胞毒性分析

2．4 统计处理

2．5 结果与分析

2．5．1 2种防腐剂和5种色素对细胞活力的影响

2．5．2 亚硫酸钠与日落黄联合作用的多指标评价

2．5．3 山梨酸钾及D-异抗坏血酸钠对细胞增殖抑制率的影响

2．5．4 山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠联合作用的多指标评价

2．6 小结与讨论

第3章 食品添加剂单独及联合作用对HepG2细胞凋亡和周期的影响

3．1 引言

3．2 材料及仪器

3．2．1 主要实验材料与试剂

3．2．2 实验仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养常规操作

3．3．2 细胞凋亡的检测

3．3．3 细胞周期的检测

3．4 统计处理

3．5 结果与分析

3．5．1 日落黄与亚硫酸钠结果分析

3．5．2 山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠结果分析

3．6 小结与讨论

第4章 食品添加剂单独及联合作用对HepG2细胞基因与蛋白的影响

4．1 引言

4．2 材料及仪器

4．2．1 主要实验材料与试剂

4．2．2 实验仪器与设备

4．2．3 实验试剂的配置

4．3 实验方法

4．3．1 细胞培养常规操作

4．3．2 实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA水平的表达

4．3．3 Western印迹法检测目的基因蛋白水平的表达

4．4 统计处理

4．5 结果与分析

4．5．1 亚硫酸钠与日落黄结果分析

4．5．2 山梨酸钾与D-异抗坏血酸钠结果分析

4．6 小结与讨论

第5章 总结与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 存在的问题与展望

参考文献

研究生期间发表论文

致谢

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