鲫鱼鱼鳞抗菌肽的制备、抑菌机理及应用研究

摘要

鲫鱼鱼鳞作为高产低值的下脚料之一，因富含蛋白质而具有较高的研究和开发价值。本研究以鲫鱼鱼鳞为原料制备抗菌肽，实现了低值原料高值化，在解决优良蛋白质资源浪费问题的同时又开发出一种新型抗菌肽。此外，本研究还对该抗菌肽的制备工艺进行了优化，对其性状表征、抑菌机理和在食品中的应用进行了研究探索，为其进一步的开发利用提供理论基础和数据支持。
　　1.为了提高酶解液的抑菌性，本研究选定碱性蛋白酶进行初步酶解，对再次酶解蛋白酶进行了筛选，并对酶解条件进行了单因素试验和响应面优化。结果表明，相比较于胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，碱性蛋白酶和酸性蛋白酶分步酶解鲫鱼鱼鳞所得酶解液的抑菌性最好。当酶解条件为再次酶解酶添加量0.05％，底物浓度30％，再次酶解pH3.0时，响应面优化结果为:初步酶解时间62 min，再次酶解时间3h，再次酶解温度34.4℃。此条件下的酶解液对副溶血性弧菌的抑菌圈直径为27.72 mm，与预测值仅相差1.3％，说明响应面分析得到的回归模型具有可靠性。
　　2.最佳条件下的酶解液经葡聚糖凝胶G-25层析后获得具抑菌性组分G2，层析后酶解液的蛋白浓度由0.50 mg/mL降至0.20 mg/mL，可见经层析分离后已去除了大部分杂蛋白，初步达到了分离纯化特定活性物质的目的。
　　3.以副溶血性弧菌为试验菌，对G2组分的稳定性和抑菌性进行研究。结果表明，该抗菌肽具有较强热稳定性但不具备酸碱稳定性，当pH值达到6.0时即失去抑菌活性。此外，G2组分对革兰氏阳性菌及阴性菌均具有较强抑菌性，对假单胞菌和希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为1.56μg/mL，低于对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌及副溶血性弧菌的MIC(6.25μg/mL);对副溶血性弧菌、假单胞菌及希瓦氏菌的最小杀菌浓度(MBC)为50μg/mL，高于对其它试验菌的MBC（6.25μg/mL）。
　　4.以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，对照组不添加抗菌肽，通过测定细菌生长曲线、菌液中相对电导率和大分子含量的变化以及显微镜观察细菌形态变化，探索鱼鳞抗菌肽的抑菌机理。结果表明，加入抗菌肽后细菌生长曲线的延迟期延长、对数生长期缩短，甚至无对数生长期出现，这说明鱼鳞抗菌肽能有效抑制细菌的正常生长繁殖。菌液的相对电导率、OD260值和可溶性蛋白含量在加入抗菌肽后显著性增加，说明在抗菌肽的作用下细胞膜通透性和完整性发生了变化。形态观察结果显示经鱼鳞抗菌肽处理12 h后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞完全失去原有的细胞形态特征，菌体粘连成团，发生严重的溶菌现象。综合分析得，鱼鳞抗菌肽主要以作用于细胞壁膜系统的抑菌机制对细胞造成杀伤作用。
　　5.以色差、pH值、菌落总数、TVB-N及感官评分为指标，以未处理的鱼块为对照，研究不同浓度(0.2、0.4 mg/mL)鱼鳞抗菌肽处理对鱼块在4℃贮藏过程中品质的影响。结果表明，鱼鳞酶解液能有效抑制鱼块中的细菌生长，进而阻止鱼肉蛋白分解，保持鱼肉色泽及感官品质，达到延长保质期的效果，其中，0.2 mg/mL抗菌肽可延长鱼块1～2天货架期，0.4 mg/mL抗菌肽可延长4天货架期，这一结果进一步提高了将鱼鳞抗菌肽作为天然食品防腐剂应用于食品保鲜中的可靠性。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 食品防腐剂的概述

1．2 抗菌肽的概述

1．2．1 抗菌肽的分类

1．2．2 抗菌肽的制备方法

1．2．3 抗菌肽的生物活性

1．2．4 抗菌肽的抑菌机理

1．3 抗菌肽的开发应用前景

1．3．1 抗菌肽在食品行业中的应用

1．3．2 抗菌肽在养殖业中的应用

1．3．3 抗菌肽在医药行业中的应用

1．4 立题的目的及意义

1．5 本课题研究的主要内容

第2章 双酶酶解法制备鱼鳞抗菌肽

2．1 试验材料、试剂及设备

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器及设备

2．2 试验方法

2．2．1 基本成分测定

2．2．2 抗菌肽的制备

2．2．3 抑菌性能测定

2．2．4 双酶酶解制备工艺优化

2．2．5 水解度测定

2．2．6 数据处理

2．3 结果与讨论

2．3．1 鱼鳞基本成分

2．3．2 再次酶解酶的筛选

2．3．3 单因素试验分析

2．3．4 Box-Beheken试验结果分析

2．3．5 最佳酶解条件的验证

2．4 小结

第3章 鱼鳞抗菌肽的粗分离及性状表征

3．1 试验材料、试剂及设备

3．1．1 材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器及设备

3．2 试验方法

3．2．1 抗菌肽的制备

3．2．2 葡聚糖凝胶G-25柱层析

3．2．3 蛋白质含量测定

3．2．4 热稳定性研究

3．2．5 酸碱稳定性研究

3．2．6 广谱抑菌性研究

3．2．7 MIC和MBC测定

3．2．8 数据处理

3．3 结果与讨论

3．3．1 葡聚糖凝胶G-25柱层析分离结果

3．3．2 蛋白质含量测定

3．3．2 鱼鳞抗菌肽的热稳定性分析

3．3．3 鱼鳞抗菌肽的酸碱稳定性分析

3．3．4 鱼鳞抗菌肽的广谱抑菌性分析

3．3．5 鱼鳞抗菌肽的MIC和MBC测定

3．4 小结

第4章 鱼鳞抗菌肽的抑菌机理初步研究

4．1 试验材料、试剂及设备

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．1 鲫鱼鱼鳞抗菌肽的制备

4．2．2 细菌生长曲线的测定

4．2．3 菌液中相对电导率的测定

4．2．4 菌液中260 nm紫外吸收物质含量的测定

4．2．5 菌液中蛋白含量的测定

4．2．6 光学显微镜观察菌体形态变化

4．2．7 数据处理

4．3 结果与讨论

4．3．1 鱼鳞抗菌肽对细菌生长曲线的影响

4．3．2 鱼鳞抗菌肽对菌液相对电导率的影响

4．3．3 鱼鳞抗菌肽对胞内大分子物质溶出的影响

4．3．4 鱼鳞抗菌肽对菌体形态的影响

4．4 小结

第5章 鱼鳞抗菌肽在淡水鱼中的保鲜应用研究

5．1 试验材料、试剂及设备

5．1．1 材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 试验仪器及设备

5．2 试验方法

5．2．1 鱼鳞抗菌肽的制备

5．2．2 贮藏试验

5．2．3 色度测定

5．2．4 pH值测定

5．2．5 菌落总数测定

5．2．6 挥发性盐基氮(TVB-N)测定

5．2．7 感官评分

5．2．8 数据分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 鱼块在冷藏过程中色差的变化

5．3．2 鱼块在冷藏过程中pH值的变化

5．3．3 鱼块在冷藏过程中菌落总数的变化

5．3．4 鱼块在冷藏过程中TVB-N的变化

5．3．5 鱼块在冷藏过程中感官评分的变化

5．4 小结

第6章 总结、创新点及展望

6．1 总结

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

硕士期间完成的论文

致谢

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