双歧杆菌调控对虾过敏原致敏反应的效果与机理研究

摘要

食物过敏疾病一直是危害人类健康的一种潜在威胁，其中由对虾等海产品引起的食物过敏越来越受到各国公众的关注。众多研究表明，益生菌具有调控过敏反应，缓解过敏症状的免疫特性，但调控机理有待于深究。鉴于此，本研究以南美白对虾中的虾肌肉蛋白腹腔注射致敏Balb/c小鼠，并以不同时间点灌胃长婴儿双歧杆菌（Bifid obacteriuminfantis，B.infantis）菌株制备的菌悬液，结合食物过敏相关指标、不同脏器淋巴细胞中Th2/Treg细胞比例等指标的结果分析比较，确定B.infantis的最佳干预时间。采用高通量测序手段分析不同处理组小鼠肠道菌群结构的变化，流式细胞术分析B.infantis对Balb/c小鼠不同脏器中树突状细胞四种细胞亚群比例的影响，探究B.infantis对致敏小鼠的调控效果与机理。以B.infantis刺激的树突状细胞与致敏小鼠脾脏中的初始T细胞体外共培养并定向分化，同时建立体外B.infantis与致敏小鼠脾脏中初始T细胞体外共培养体系，通过测定相关细胞因子分泌量与相关基因表达量分析T细胞分化情况，初步探究益生菌调控过敏反应的机制，为今后筛选抗过敏制剂与制备抗过敏制剂方案提供可参考意见。主要研究结果如下:
　　1、采用虾肌肉蛋白腹腔注射致敏Balb/c小鼠，并以不同时间点口灌胃B.infantis菌悬液，发现B.infantis处理的预防组与治疗组都有对脏器系数、组胺含量、特异性IgE含量、肠道组织形态、免疫器官中Th2与Treg比例变化的调控效果，但经过统计学分析比较，B.infantis对南美白对虾肌肉蛋白引起的食物过敏有更佳的治疗作用。
　　2、通过对小鼠粪便16s rDNA测序并进行生物学分析，发现B.infantis不同时间的干预对致敏小鼠肠道细菌菌群结构以及多样性有不同程度的调控效果，表明对于肠道菌群结构的调节也是B.infantis对过敏反应的调控机理之一。
　　3、以B.infantis菌悬液以连续灌胃方式处理Balb/c小鼠20天，采用流式细胞仪测定派氏结、肠系膜淋巴结与脾脏淋巴细胞中CD80+、CD86+、MHC-Ⅱ+与CD103+DC细胞比例，结果表明B.infantis的灌胃处理有利于PP与MLN中DC趋于成熟，且CD103+DC细胞比例有所上调，以影响后续对初始T细胞的刺激及T细胞分化。
　　4、流式细胞分选仪分别在MLN与脾脏中分选得到DC与初始CD4+T细胞后共培养并刺激T细胞定向分化，同时建立体外B.infantis与致敏小鼠脾脏中初始T细胞体外共培养体系，测定相关细胞因子蛋白分泌水平与相关基因mRNA表达水平，结果表明，B.infantis单独处理对Treg细胞的分化没有明显的调控作用，B.infantis调控过敏反应的机理主要为影响DC细胞亚群细胞比例，从而影响随后DC刺激T细胞分化，调控初始T细胞向Treg方向极化，抑制了Th2与Th17细胞的分化状态，并调控Th1/Th2细胞间平衡。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 食物过敏及其机理

1．1．1 食物过敏

1．1．2 食物过敏原及其表位

1．1．3 食物过敏引起的肠道黏膜免疫反应机理

1．2 黏膜免疫系统在食物过敏反应中的关键调控机制

1．2．1 肠道黏膜免疫系统

1．2．2 调节性T细胞(Treg)

1．2．3 抗原呈递细胞(APC)

1．3 食物过敏中肠道菌群的调节作用

1．3．1 共生菌的调节机制

1．3．2 益生菌的调节机制

1．3．3 益生菌调节食物过敏反应的国内外现状

1．4 本课题主要研究内容与意义

1．4．1 研究目的与意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究技术路线

第2章 B．infantis不同时期的干预对对虾蛋白致敏小鼠影响的比较研究

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验对象

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．2．4 实验方法

2．2．5 数据统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 虾肌肉蛋白SDS-PAGE分析

2．3．2 B．infantis不同时期的干预对致敏小鼠组织脏器系数的影响

2．3．3 各组小鼠肠道与组织形态学观察分析

2．3．4 B．infantis不同时期的干预对致敏小鼠血清中特异性IgE、IgG2a含量的影响

2．3．5 B．infantis不同时期的干预对致敏小鼠血清中组胺含量的影响

2．3．6 B．infantis不同时期的干预对致敏小鼠不同组织Th2和Treg细胞数量的影响

2．3．7 B．infantis不同时期的干预对致敏小鼠不同组织细胞因子含量的影响

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 B．infantis的干预对虾肌肉蛋白致敏小鼠粪便菌群结构影响的研究

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验对象

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．2．4 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 小鼠粪便菌群多样性分析

3．3．2 小鼠粪便菌群在门水平上的结构分析

3．3．3 小鼠粪便菌群在属水平上的结构分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 B．infantis及其调节的DC对致敏小鼠初始T细胞定向分化影响的比较研究

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验对象

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要仪器

4．2．4 实验方法

4．2．5 数据统计学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 B．infantis对Balb／c小鼠不同组织中DC细胞亚群比例的影响

4．3．2 DC与初始CD4+T细胞分选

4．3．3 B．infantis调节的DC对小鼠初始CD4+T细胞定向分化的影响

4．3．4 B．infantis对小鼠初始CD4+T细胞定向分化的影响

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 总结论、创新点及研究展望

5．1 总结论

5．2 创新点

5．3 研究展望

参考文献

致谢

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