不同壁材和芯材脂质体的消化特性及其对Caco-2细胞的影响

摘要

脂质体(Liposome)是由磷脂等两性分子的疏水尾部避开水相聚集在一起，而亲水头部暴露在水相，形成具有类细胞膜结构的双分子层闭合囊泡，具有保护、靶向、缓释、无毒等优点，作为一种微胶囊运载体系已在医药、化妆品、食品等领域表现出极大潜能。磷脂作为脂质体主要的壁材物质，其种类与结构不同，所形成的脂质体递送效率以及在胃肠道的消化特性也不同。乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种具有抗菌、抗氧化、抗病毒、免疫调节以及递送铁离子等多重生物活性的蛋白质，作为一种食品营养强化剂已被广泛应用。天然多酚类化合物槲皮素(Quercetin，QUE)和白藜芦醇（Resveratrol，RES）具有抗氧化、抗菌、降血压、降血脂以及保护心血管等作用，已在保健品以及功能食品中广泛应用。但是LF容易被胃蛋白酶消化，QUE和RES易受温度、pH等因素影响，从而降低其生物活性且影响人体吸收利用。
　　针对脂质体运载体系本身结构与性质的关系和功能性芯材物质存在的一些问题，本论文首先以LF为模型包埋物，分别以不同结构的磷脂（包括脂肪酸链长度、脂肪酸链不饱和度、头部基团种类）为主要壁材，制备结构不同的LF脂质体，通过分析其在体外胃肠道消化过程中平均粒径及颗粒分布、Zeta电位、表面微观特征、芯材LF释放率、以及磷脂双分子层膜的结构等的变化，探究不同壁材结构脂质体的消化特性，从而择优脂质体壁材;在最佳壁材脂质体基础上，探究QUE脂质体和RES脂质体在胃肠道的消化特性，并且深入研究小肠中（不含胰酶）不同胆盐浓度对脂质体结构的影响;最后，借助Caco-2细胞模型，进一步探究经过胃肠消化的QUE脂质体和RES脂质体对Caco-2细胞的毒性以及在小肠的吸收量。本论文主要结论如下:
　　（一）不同壁材结构脂质体在胃肠道的消化特性
　　磷脂脂肪酸主链碳原子个数为16、18、20的磷脂制备的脂质体平均粒径分别为300±61nm、700±42nm、400±34nm，具有不同头部基团的磷脂，包括PA、PC、PE、PI，制备的脂质体平均粒径分别为300±79nm、700±42nm、200±76nm、300±25nm，脂肪酸链不饱和度分别为0、1、2、3的磷脂制备的脂质体平均粒径分别为700±42nm、800±10nm、400±50nm、600±69nm。在胃消化阶段，不同壁材结构脂质体的颗粒破坏度、膜结构变化较小，LF释放也较少，表明不同壁材结构脂质体在胃的低酸环境以及胃蛋白酶存在的下依然可以保持结构稳定。在小肠消化阶段，不同壁材结构脂质体颗粒破坏程度加强、双分子层膜结构基本消失，芯材大量释放，表明不同壁材结构脂质体在小肠中受胰酶和胆盐的作用明显。另外，脂肪酸链碳原子个数为16、18、20的磷脂制备的脂质体结构变化基本一致，但是PC磷脂及其脂肪酸链不饱和度为0（完全饱和）的磷脂制备的脂质体，在胃肠消化过程中其结构相对稳定。
　　（二）不同芯材种类（多酚）脂质体在胃肠道的消化特性
　　QUE脂质体和RES脂质体粒径分别为1000±78nm和1200±62nm左右，包封率分别为78.06±0.02％和85.12±0.01％。两种芯材种类脂质体在胃消化后颗粒分布、表面电位、官能团结构等变化较小，结构稳定;小肠消化后，QUE脂质体和RES脂质体包封率降低至30.00±0.5％以下。另外，QUE脂质体在低胆盐浓度下结构特性受影响较小，受高胆盐浓度影响较大。
　　（三）QUE脂质体和RES脂质体对Caco-2细胞的影响
　　QUE/R ES含量在80μM以下时，两种脂质体对Caco-2细胞的抑制始终低于15.00±0.5％，同时细胞凋亡率也在20.00±0.5％以下，且与对照组没有明显差异，说明经过胃肠消化的QUE脂质体和RES脂质体对细胞生长没有明显抑制以及毒害作用，经脂质体包埋的QUE和RES在Caco-2细胞的吸收量明显高于未包埋的QUE和RES。
　　本论文深入探究了脂质体壁材和芯材结构与消化特性的关系，为有针对性制备具有特殊胃肠道消化稳定性的脂质体提供理论指导;研究了多酚类脂质体经体外模拟消化后的细胞毒性和吸收利用率，为其他微胶囊运载体系以及营养素的消化吸收及生物利用的研究提供技术借鉴。

目录

摘要

第一章 前言

1．1．1 脂质体定义及结构

1．1．2 脂质体分类及质量控制

1．1．3 脂质体的制备方法

1．1．4 脂质体技术在食品中的应用

1．2 脂质体壁材结构

1．2．1 传统脂质体的壁材结构

1．2．2 新生代脂质体

1．3 脂质体芯材种类

1．3．1 水溶性芯材脂质体

1．3．2 脂溶性芯材脂质体

1．4 脂质体体外消化研究现状

1．5 脂质体在Caco-2细胞模型的吸收及转运

1．6 选题意义

1．7 研究内容

第二章 不同壁材脂质体与胃肠道消化的关系

2．1 引言

2．2 实验试剂及仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 不同壁材脂质体的制备

2．3．2 体外胃肠消化模型的建立

2．3．3 粒径和电位

2．3．4 颗粒分布

2．3．5 膜的微极性

2．3．6 微观膜结构表征(TEM)

2．3．7 表面形态表征(FAM)

2．3．8 芯材释放动力学

2．4 结果与讨论

2．4．1 粒径和电位研究

2．4．2 颗粒分布跟踪

2．4．3 脂质体膜的微极性分析

2．4．4 微观膜结构变化(TEM)

2．4．5 表面形态变化(FAM)

2．4．6 芯材的释放研究

2．5 本章小结

第三章 不同芯材(多酚)脂质体与胃肠道消化的关系

3．1 引言

3．2 实验试剂及仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 不同芯材脂质体的制备

3．3．2 体外胃肠消化模型的建立

3．3．3 粒径和电位测定

3．3．4 颗粒分布

3．3．5 膜的微极性测定

3．3．6 微观膜结构(TEM)

3．3．7 傅里叶红外光谱结构(Fourier Transform Infrared，FTIR)

3．3．8 包封率测定

3．3．9 胆盐浓度对脂质体结构的影响

3．4 结果与分析

3．4．1 脂质体粒径电位与消化的关系

3．4．2 颗粒分布

3．4．3 膜的微极性研究

3．4．4 微观膜结构变化(TEM)

3．4．5 官能团结构变化

3．4．6 包封率研究

3．4．7 胆盐浓度对脂质体结构的影响

3．5 本章小结

第四章 QUE脂质体和RES脂质体对肠道Caco-2细胞的影响

4．1 引言

4．2 实验试剂及仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3．1 脂质体预消化

4．3．2 细胞培养常规操作

4．3．3 细胞增值与抑制检测(CCK-8试剂盒法)

4．3．4 细胞凋亡检测

4．3．5 细胞吸收量测定(BCA法测细胞总蛋白含量、HPLC-MS法测QUE／RES含量)

4．4 结果与讨论

4．4．1 细胞增值与抑制(CCK-8法)

4．4．2 细胞凋亡

4．4．3 细胞吸收

4．5 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 存在的问题与展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢

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