条斑紫菜多糖的降解、分离纯化及生物活性研究

摘要

条斑紫菜是一种分布在江苏沿海地区的经济型褐藻，含有蛋白质、多糖、维生素和矿物质等营养成分。研究表明条斑紫菜多糖具有抗炎症、降血脂、抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化等多种生物活性。本论文旨在为研发具有良好抗氧化、降血脂、提高免疫力活性的条斑紫菜多糖相关功能性食品提供理论依据。多糖的生物活性常与其空间结构和分子量有关，为了提高其生物活性，本文以条斑紫菜为原料采用水提醇沉法提取条斑紫菜粗多糖，用过氧化氢和抗坏血酸联合的方法对条斑紫菜粗多糖进行降解，对降解多糖进行分离纯化后再对纯化的组分进行化学成分分析、结构分析、体外免疫活性和体外抗氧化活性研究。 主要研究结果如下: 1.用水提醇沉法从条斑紫菜中提取条斑紫菜多糖(PSPY)，提取率为9.7％。用过氧化氢-抗坏血酸联合的方法对条斑紫菜多糖进行降解，经单因素实验和响应面优化，得出最优的降解条件:降解剂浓度为4.1mM、降解温度为52.4℃、降解时间为2.1h，降解多糖(DPSPY)的得率为73.89％。 2.对PSPY和DPSPY进行化学成分分析，发现降解后多糖的总糖含量和硫酸基含量提高，蛋白质含量降低，高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测得降解前后多糖的峰位分子量分别为4.52×105和1.70×104。经红外光谱扫描分析后发现降解前后多糖的结构没有发生明显的改变。通过对PSPY和DPSPY的还原力、DPPH自由基的清除活性、·OH自由基的清除活性和O2-自由基的清除活性的研究发现，DPSPY的还原力和三种自由基的清除活性显著高于PSPY。以考来烯胺为阳性对照，纤维素为阴性对照，发现DPSPY对胆汁酸的结合能力强于PSPY。 3.DPSPY经DEAE Cellulose-52和SephadexG-100进行分离纯化后得到DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M四个组分， DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M的相对分子量分别为1.08×104、1.07×104、1.87×104和3.55×104，总糖含量分别为75.86％、78.40％、78.54％、79.20％，蛋白质含量为0.72％、未检测出、0.24％和未检测出，硫酸基含量为4.9％、16.93％、17.10％和17.76％。GC-MS分析发现各组分都主要是半乳糖组成，并含有少量的葡萄糖、甘露糖、木糖和鼠李糖组成。紫外-可见光全波段扫描可知DPSPY-0和DPSPY-0.3M含有少量的糖蛋白基本不含核酸及色素。DPSPY-0.1M和DPSPY-0.5M基本不含核酸、蛋白质及色素。红外光谱分析四种分离纯化组分均具有多糖的特征吸收峰，均为吡喃糖。核磁共振光谱分析可知条斑紫菜降解多糖的四个分离纯化组分均为同时存在α-型和β-型糖苷键的吡喃糖。 4.利用细胞模型实验比较了PSPY、DPSPY、DPSPY-0、DPSPY-0.1M、DPSPY-0.3M和DPSPY-0.5M的体外免疫活性。结果表明条斑紫菜多糖、降解多糖及其分离纯化组分都具有一定的促进RAW264.7巨噬细胞增殖的作用，都具有增强RAW264.7巨噬细胞吞噬中兴红的能力，DPSPY和DPSPY-0.5M具有促进RAW264.7巨噬细胞分泌细胞因子NO的能力。 5.铁还原力和自由基（DPPH、·OH、O2-）清除实验结果表明，四个纯化组分中DPSPY-0的抗氧化活性最小，DPSPY-0.5M的抗氧化活性最强。各纯化组分的抗氧化活性强弱顺序与其硫酸基含量高低顺序基本一致。

目录

摘要

论文说明

第1章引言

1．1海藻多糖的研究进展

1．1．1紫菜多糖的研究概况

1．1．2海藻多糖制备方法的研究概况

1．2．紫菜多糖的降解方法

1．2．1超声波降解法

1．2．2酶降解法

1．2．3化学降解法

1．3海藻多糖的生物活性

1．3．1海藻多糖的免疫活性

1．3．2海藻多糖的降血脂作用

1．3．3海藻多糖的体外抗氧化作用

1．3．4其他活性

1．4课题研究的背景及意义

1．5本课题研究内容

第2章条斑紫菜粗多糖的提取及降解条件的优化

2．1实验材料与设备

2．1．1实验材料与试剂

2．1．2实验设备

2．2实验方法

2．2．1条斑紫菜多糖的提取

2．2．2条斑紫菜粗多糖的降解

2．2．3降解条件的优化

2．2．4降解多糖的制备

2．3结果分析

2．3．1 H2O2-Vc法降解单因素实验结果

2．3．2响应面优化实验结果

2．4小结

第3章条斑紫菜降解多糖的组成分析及活性研究

3．1实验材料及设备

3．1．1实验材料

3．1．2实验器材

3．2实验方法

3．2．1条斑紫菜粗多糖和降解产物化学组成分析

3．2．2紫外光谱分析

3．2．3红外光谱分析

3．2．4 HPGPC测定多糖分子量

3．2．5条斑紫菜多糖体外抗氧化实验

3．2．6体外胆汁酸结合能力

3．3实验结果分析

3．3．1条斑紫菜粗多糖降解多糖的化学组成分析

3．3．2 PSPY和DPSPY的紫外光谱分析

3．3．3红外光谱分析

3．3．4 HPGPC测定多糖分子

3．3．5体外抗氧化实验

3．3．6胆汁酸结合能力

3．4本章小结

第4章条斑紫菜降解多糖的分离纯化及组分分析

4．1材料和仪器

4．1．1实验材料与试剂

4．1．2实验仪器

4．2实验方法

4．2．2 Sephadex G-100凝胶色谱柱进一步纯化

4．2．3各纯化组分的纯度鉴定

4．2．4各个纯化组分组成分析

4．2．5 GC-MS测定单糖组成

4．2．6红外光谱分析

4．2．7 13C NMR和1HNMR谱图分析

4．3结果与分析

4．3．2 Sephadex G-100凝胶进一步分离纯化

4．3．3各级纯化组分的纯度分析

4．3．4各级分离纯化组分的组成分析

4．3．5 GC-MS测定单糖组成

4．3．6红外光谱分析

4．3．7 13C NMR和1HNMR谱图分析

4．4本章小结

第5章各纯化组分的体外免疫活性及抗氧化的研究

5．1实验材料与设备

5．1．1实验材料与试剂

5．1．2实验仪器

5．2实验方法

5．2．1各纯化组分的体外免疫活性的研究

5．2．2各纯化组分的体外抗氧化活性

5．2．3数据处理与分析

5．3结果与讨论

5．3．1 MTT法检测各组分对RAW264．7巨噬细胞增殖的影响

5．3．2中性红法检测各组分对RAW264．7细胞吞噬活性的影响

5．3．3 Griess法检测多糖样品对RAW264．7细胞分泌NO的影响

5．3．4各纯化组分的还原力

5．3．5各纯化组分清除DPPH能力

5．3．6各纯化组分的羟基自由基清除实验

5．3．7各纯化组分的超氧阴离子自由基清除实验

5．4本章小结

6．1结论

6．2创新点

6．3展望

参考文献

附录

致谢

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