基于静电纺纳米纤维膜的Caco--2细胞模型构建及其槲皮素吸收机制研究

摘要

Caco-2细胞是一种人源结肠腺癌细胞，同源性好，生命力强，经过培养，可形成连续的细胞单层，并在形态和功能上分化出与成熟小肠上皮细胞相近的状态。因此，Caco-2细胞被广泛用于体外肠道模型的构建。作为附着依赖性细胞，单层培养模型是Caco-2细胞最常见的培养模型。在经典的Transwell模型中，插入式半透滤膜上培养的Caco-2细胞单层是应用最为广泛的一种体外肠道模型。但是，这种模型中的细胞培养周期长达21天，并且存在着操作复杂、耗费较大、筛选通量不高等问题。 为了构建一种新型的Caco-2细胞模型，探究该模型在研究功能性成分吸收转运方面的可行性，本课题基于纳米纤维膜在组织工程中的应用优势，拟用纳米纤维膜作为Caco-2细胞的载体材料，构建体外肠道模型，使Caco-2细胞充分表达出小肠上皮所具有的独特生理功能，实现对营养物质和药物分子口服吸收行为的预测。 基于此目的，本文首先从四种静电纺纳米纤维膜中筛选出了适合Caco-2细胞贴附生长的静电纺聚乳酸纳米纤维膜，作为Caco-2细胞培养的载体材料。Caco-2细胞形态学以及渗透实验表明，基于静电纺聚乳酸纳米纤维膜的Caco-2细胞模型中，培养4天时，Caco-2细胞即可形成紧密的细胞单层;单层细胞的完整性结果表明，培养4天时，完整的细胞单层已形成;培养7天时，Caco-2细胞已经分化成熟;碱性磷酸酶和P-糖蛋白的活性检测结果表明，培养至第9天时细胞的碱性磷酸酶活性和转运蛋白的活性已经达到较高的水平，超过传统Transwell插入式半透滤膜模型内培养21天的Caco-2细胞。可见，此模型的培养周期相对于传统培养模型大为缩短。 随后，基于静电纺聚乳酸纳米纤维膜的Caco-2细胞模型被用于预测槲皮素的吸收，结果表明，槲皮素的跨膜转运呈pH依赖，需通过添加P-gp抑制剂来了解是否槲皮素是P-gp的底物，是否存在外排作用。同时，槲皮素在高浓度下的跨膜转运机制以被动扩散为主。 总的来说，基于静电纺聚乳酸纳米纤维膜构建的Caco-2细胞模型能在4天内形成完整致密的细胞融合单层，培养至7天，Caco-2细胞已分化成熟，即可用于吸收实验。因此，基于静电纺聚乳酸纳米纤维膜的Caco-2细胞模型可快速构建并该模拟肠道模型具备评价营养和药物组分在小肠中吸收的能力。

目录

摘要

第一章前言

1．1小肠的生理构造

1．2 Caco-2细胞

1．3基于Caco-2细胞的常用肠道模型

1．4肠道模型的改进

1．4．1培养基的改进

1．4．2载体材料的改性

1．4．3生物反应器的改进

1．4．4微流体系统的改进

1．5纳米纤维

1．5．1纳米纤维概念及其特点

1．5．2纳米纤维的制备方法

1．5．3在组织工程中的应用

1．6肠道吸收研究方法

1．6．1体内法

1．6．2在体法

1．6．3体外法

1．7研究目的和意义

1．8研究内容

第二章用Caco-2细胞培养静电纺纳米纤维的制备和筛选

2．1引言

2．2实验部分

2．2．1实验原料

2．2．2仪器

2．3静电纺丝制备纳米纤维膜

2．3．1聚丙烯腈纳米纤维膜的制备

2．3．2聚乳酸纳米纤维膜的制备

2．3．3醋酸纤维素纳米纤维膜的制备

2．3．4聚己内酰胺纳米纤维膜的制备

2．3．5细胞培养

2．3．6静电纺纳米纤维膜培养Caco-2细胞

2．3．7静电纺纳米纤维膜的红外分析

2．3．9扫描电子显微镜

2．3．10数据统计分析

2．4实验结果与分析

2．4．1静电纺聚丙烯腈纳米纤维膜

2．4．2静电纺聚乳酸纳米纤维膜

2．4．3静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜

2．4．4静电纺聚己内酰胺纳米纤维膜

2．4．5静电纺纳米纤维膜的细胞毒性检测

2．4．6静电纺聚乳酸纳米纤维膜的化学结构

2．5本章小结

第三章静电纺聚乳酸纳米纤维膜上Caco-2细胞功能分析

3．1引言

3．2实验部分

3．2．1实验原料

3．2．2仪器

3．2．3静电纺聚乳酸纳米纤维膜插入式Transwell模型制备

3．2．8细胞计数

3．2．9细胞琥珀酸脱氢酶活性测定

3．2．10激光共聚焦荧光显微镜

3．2．11 Caco-2细胞TEER值变化

3．2．12苯酚红通透性的测定

3．2．13碱性磷酸酶(ALP)活性测定

3．2．14细胞转运蛋白活性的测定

3．2．15数据统计分析

3．3实验结果与分析

3．3．1扫描电子显微镜

3．3．2透射电子显微镜

3．3．4 Caco-2细胞琥珀酸脱氢酶活性

3．3．5 Caco-2细胞的CLSM结果

3．3．6细胞层的旁路渗透性质

3．3．7 Caco-2细胞层跨膜电阻

3．3．8 Caco-2细胞内碱性磷酸酶活性

3．3．9 Caco-2细胞内转运蛋白的活性

3．4本章小结

第四章Caco-2细胞肠道模型用于槲皮素吸收机制研究

4．1引言

4．1．1槲皮素的理化性质

4．2实验部分

4．2．1实验原料

4．2．4槲皮素HPLC分析方法的建立

4．2．5跨膜转运实验

4．2．6数据统计分析

4．3实验结果与分析

4．3．1槲皮素的HPLC检测标准曲线

4．3．2细胞存活率

4．3．3不同浓度对槲皮素跨膜转运的影响

4．3．4不同时间对槲皮素跨膜转运的影响

4．3．5不同pH对槲皮素跨膜转运的影响

4．4本章小结

5．1总结

5．2论文主要创新点

5．3展望

参考文献

声明

致谢