大肠杆菌LTKA63及LTB和霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达和鉴定

摘要

基因工程疫苗多以单一蛋白作为抗原,其免疫效果常不尽人意,通常需要使用佐剂来提高此类疫苗的免疫效果.霍乱肠毒素B亚单位(CTB)一直是效果较为公认的粘膜免疫佐剂,但近年文献报道重组CTB与抗原混合后诱导S-IgA产生的能力弱或无,但诱导血清IgG作用较强.CTB的佐剂活性主要依赖其与细胞表面神经节苷酯(GM<,1>)结合的活性.由于CTB主要通过激活Th2途径发挥其佐剂活性,但Th2途径可产生IL-4,IL-4能选择性地促进IgE合成,因而认为CTB可引起变态反应.大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是近年报道较多的粘膜免疫佐剂,因其肠毒性而在实际应用中受到限制.LT分子结果与CT类似,一个A亚单位和五个相同的B亚单位组成.A亚单位具有ADP-核糖转移酶活性,是毒素的毒性部位.B亚单位能与哺乳动物细胞表面神经节苷脂GM<,1>结合,介导A亚单位进入靶细胞.不少研究结果证实,将LT第63位丝氨酸突变为赖氨酸的突变体(LTK63)的毒性几乎完全全消失,但其免疫佐剂活性不变.很多文献报道,单一使用LTKA63或LTB也具有粘膜免疫佐剂活性.LTB的佐剂作用也依赖其与细胞表面神经节苷酯(GM<,1>)结合的活性,LTKA63的作用机制尚不清楚,但大部分研究者认为与其ADP-核糖转移酶活性无关.LT主要激活Th1途径,其次是Th2途径,帮认为LT一般不引起变态反应.令人感兴超的是,LTKA63和LTB佐剂活性的作用机制不同,两者合用可能有协同效应.综上所述,LTK63、LTKA63或LTB较之CTB更适合作为口服基因工程疫苗的佐剂.结论:1、该研究成功地构建了LTKA63、LTB和CTB高效原核表达系统.2、所表达的rLTB和rCTB具有粘膜佐剂活性.

目录

前言

第一部分大肠肝菌44815株的分离培养

第二部分大肠杆菌44815株和霍乱弧菌东-74株培养物基因组DNA的提取

第三部分聚合酶链聚合反应扩增LTA、LTB和CTB基因

第四部分TA克隆和测序

第五部分LTA基因点突变成LTKA63

第六部分原核表达载体的构建

第七部分：融合蛋白的表达与纯化

第八部分融合蛋白佐剂活性的研究（GM1-ELISA）

第九部分：讨论

第十部分：参考文献

综述：百日咳鲍特菌外膜蛋白的致病性与免疫原性

致谢