乙型肝炎病毒细胞核转位动态监测及HBV cccDNA荧光定量PCR分析研究

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的生活周期可以分成以下几个阶段:病毒黏附宿主细胞;病毒穿透细胞膜,进入细胞;释放病毒基因组;表达病毒基因产物;复制病毒基因组;组装病毒病毒颗粒;释放病毒.该研究第一部分采用细胞生物学技术和同位素示踪技术分析HBV核衣壳蛋白、基因组在HBV侵入肝细胞过程中的定位及动态变化,并阐明在HBV穿越细胞核膜过程中,核衣壳蛋白是否需要先蜕去这个问题.HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular,cccDNA)是HBV复制过程中最为关键的中间体形态.HBV基因组在聚合酶作用下将部分双链开环结构补足成完整双链开环结构,然后在细胞核内连接酶作用下把双链中原先存在的缺口补平,形成共价闭合环状DNA结构,也就是cccDNA.HBV cccDNA在细胞核内RNA聚合酶作用下,转录产生多种RNA,其中中间体RNA是形成子代HBV Dane颗粒前提RNA.从病毒生活周期分析,HBV cccDNA是病毒复制以及致病机理的关键所在.此外,HBV cccDNA可与细胞核内的核蛋白结合,形成稳定的微染色体(mini-chromosome)结构,抗病毒药物很难清除它.由于肝细胞往往处在细胞复制周期的G<,0>期,降解HBV cccDNA很难,所以它的自然半衰期就比较长.除HBV基因组整合外,目前临床应用的抗HBV药物和正在研究的治疗乙肝药物的最迫切需要解决的就是消除HBV cccDNA,但是目前没有便捷、准确、灵敏度高的方法可以供临床动态监测HBV cccDNA.Southen blot是检测HBV cccDNA的经典方法,但是该方法过程比较复杂,操作可控性比较差,而且灵敏度不高.Addison等发展了一种能相对定量DHBV的竞争PCR方法,虽然该方法灵敏度有了提高,但是在整个操作过程中仍需进行凝胶电泳、转膜和<'32>p标记的同位素探针杂交.PCR技术是非常灵敏、便捷的方法,但是由于HBV cccDNA与其它HBV DNA形态非常接近,很难设计出仅仅扩增HBV cccDNA而不扩增其它HBV DNA的PCR方法.该研究第二部分设计了一条特殊的嵌合引物,在该引物的5'端加入与HBV基因组无关的序列,在通过一次单链延伸反应和一次实时荧光定量PCR程序,成功把HBV cccDNA和非cccDNA形态的其它HBV开环DNA结构区分开,并通过荧光探针杂交,实现高灵敏度、实时定量检测.

目录

论文一乙型肝炎病毒细胞核转位动态监测

一、实验材料、试剂、设备

二、技术路线

三、实验方法

四、实验结果

五、讨 论

六、结 论

七、参考文献

论文二乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量PCR检测体系建立及应用

一、实验材料、试剂、设备

二、实验方法

三、结果

四、讨 论

五、结 论

六、参考文献

综 述：乙型肝炎病毒生活周期研究若干进展

附 录：作者简介及攻读博士学位期间发表论文及参加的科研项目

致谢