药物转运细胞模型的建立、应用和相关机制的初步研究

摘要

本论文建立了Caco-2体外肠道吸收模型和稳定的高表达P-糖蛋白细胞系。建立了耐阿霉素的K562/ADR细胞，并用双向电泳和质谱寻找与K562/ADR细胞转运机制相关的蛋白。研究了普萘洛尔对映体在Caco-2细胞单层的转运和积聚；在K562和K562/ADR细胞内的积聚。考察了银杏黄酮苷元在Caco-2细胞单层的转运以及与P-糖蛋白的相互作用。具体研究如下： 第一部分Caco-2体外吸收模型的建立和应用 Caco-2细胞种于TranswellTM板培养21天，跨膜电阻达500Ωcm2左右；LuciferyellowCH的Papp为1.65±0.79×10-7cm/s，普萘洛尔的Papp为1.42±0.18×10-5cm/s；透射电镜观察细胞单层有紧密连接结构，微绒毛分化良好，多而致密；分化的另一标志物碱性磷酸酶的表达很高；P-糖蛋白也有表达。 银杏黄酮苷元槲皮素、山奈酚和异鼠李素在Caco-2细胞单层的转运研究发现，这三种化合物都存在外排现象，也就是B侧到A侧的转运大于A侧到B侧(槲皮素p＜0.01，山奈酚和异鼠李素p＜0.001，Student'st-test)。 反相高效液相色谱检测转运液中普萘洛尔(PPL)单个对映体的方法建立。流动相为甲醇－乙腈-pH4.0磷酸缓冲液(10：45：45，v/v/v)；流速为0.9ml/min；柱温：25℃；检测波长是220nm。普萘洛尔对映体在0.2-20μmol/L范围内线性良好，回收率为98.8-101.8﹪。检测限均为0.005μmol/L，定量限均为0.2μmol/L(RSD＜10﹪)。日内、日间精密度的RSD均小于10﹪。 不同浓度的普萘洛尔在Caco-2细胞的转运和积聚的结果显示：S-PPL在A侧到B侧的透过要大于R-PPL，但在B侧到A侧，R-PPL的透过量要大于S-PPL；普萘洛尔的积聚也有立体选择性。普萘洛尔A侧到B侧的透过受A侧pH的影响，当pH为6.5时，两对映体的透过均减少。该药物在Caco-2细胞内的积聚也受pH的影响。普萘洛尔对映体在B侧到A侧的转运不受维拉帕米、环孢菌素A、吲哚美辛、西咪替丁和哇巴因的影响；除了维拉帕米能增加普萘洛尔对映体的积聚外，其余抑制剂对普萘洛尔在Caco-2细胞的积聚无影响。 第二部分P-糖蛋白高表达细胞系的建立和应用 质粒pMDRA1中的全长MDR1cDNA片断经酶切亚克隆至载体pET-28a(+)，重组质粒中的全长MDR1cDNA片断经酶切与真核表达载体pcDNA3.1(+)相连，酶切和DNA测序确认表达载体构建正确。质粒pcDNA3.1(+)/MDR1通过SuperfectTransfection转染试剂转染乳腺癌细胞Bcap37，经G418筛选获得抗性克隆。所建立的Bcap37/MDR1细胞与转染了空载体pcDNA3.1(+)的Bcap37细胞相比，实时荧光定量RT-PCR发现MDR1的mRNA表达明显升高，Westernblot表明P-糖蛋白的表达发生从无到有的变化，免疫组化显示P-糖蛋白定位于Bcap37/MDR1细胞的细胞膜上。在药敏试验中，Bcap37/MDR1细胞对阿霉素和秋水仙碱的敏感性远低于对照细胞。 反相高效液相色谱检测Bcap37细胞内三种银杏黄酮苷元槲皮素、山奈酚、异鼠李素的方法建立。流动相为pH2.0磷酸缓冲液－四氢呋喃－甲醇－异丙醇(65：15：10：20，v/v/v/v)；流速为0.5ml/min；柱温为室温；检测波长是380nm。三种银杏黄酮苷元在0.1-1.0μmol/L范围内线性良好，绝对回收率为70﹪左右。槲皮素和山奈酚的检测限为0.01μmol/L，异鼠李素的检测限为0.05μmol/L。三种黄酮醇的定量限均为0.1μmol/L(RSD＜10﹪)。日内、日间精密度的RSD均小于10﹪。 槲皮素、山奈酚、异鼠李素在Bcap37/MDR1细胞内的积聚低于对照细胞(槲皮素p＜0.05，异鼠李素p＜0.01，MannWhitneyUtest)；当与P-糖蛋白抑制剂维拉帕米共孵育，三种黄酮在Bcap37/MDR1细胞内的积聚增加(山奈酚p＜0.05，MannWhitneyUtest)。用ATP酶法考察P-糖蛋白与黄酮的相互作用，槲皮素和山奈酚抑制P-糖蛋白的ATP酶活性，而异鼠李素有刺激ATP酶的作用(p＜0.05，MannWhitneyUtest)。 第三部分K562耐药细胞的建立、应用和相关蛋白表达改变的研究 将K562细胞与阿霉素(ADR)共同培养，逐渐增加药物浓度，最后建立耐阿霉素的细胞K562/ADR。MTT法检测阿霉素(ADR)、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和长春新碱(VCR)对K562和K562/ADR细胞的半数抑制率(IC50)。结果表明K562细胞经ADR诱导后出现多药耐药现象，ADR、DDP、5-FU和VCR对K562/ADR细胞的IC50明显高于K562细胞(ADRp＜0.05，VCRp＜0.001)。流式细胞仪检测，在K562细胞表达P-糖蛋白的细胞占0.68﹪，而K562/ADR细胞中有88.79﹪的细胞表达该蛋白。

目录

摘要

第一部分 Caco-2体外吸收模型的建立和应用

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 P-糖蛋白高表达细胞系的建立和应用

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

第三部分 K562耐药细胞的建立、应用和相关蛋白表达改变的研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

附录

致 谢