油菜蜂花粉抗前列腺癌活性成分筛选及其作用机制研究

摘要

前列腺癌是西方国家男性常见的肿瘤,在美国,该病已成为导致男性肿瘤患者致死的第二位原因。在我国,其发病率虽远低于西方国家,但呈显著增长的趋势。因此,在我国开展前列腺癌防治研究具有重要的现实意义。
　　 近年来,随着诊断水平的提高和普查工作的开展,局限性的前列腺癌已经能够得到早期发现和及时治疗。但即使是在这种情况下,还是约有30-40％的患者在确诊时前列腺癌细胞就已经发生扩散。众所周知,前列腺以外的癌细胞已不可能通过手术或放疗将其完全清除。由于大多数此类患者的前列腺癌细胞生长最初均表现出对雄激素的依赖性,故去除雄激素为此类患者非手术治疗的主要方法,尤其在对晚期前列腺癌的姑息疗法中已广泛应用。然而,当患者采用对抗雄激素治疗后,约经过大约18-36个月的缓解期,最终都不可避免地进入到激素非依赖性前列腺癌状态。激素非依赖性前列腺癌的治疗极为棘手,患者预后不良。因此,开发新型抗前列腺癌药物、特别是针对激素非依赖性前列腺癌的治疗方法是其治疗的关键所在。
　　 蜂花粉是一种包含多种生物活性成分的天然药物,国内外已有多种的蜂花粉类制剂用于临床。该类药物多用于前列腺相关疾病的防治,其中又以治疗前列腺增生为主。相关研究表明,某些花粉类药物中存在着选择性抑制前列腺癌细胞、特别是激素非依赖性癌细胞体外增殖的活性成分,提示此类药物可能具有抗激素非依赖性前列腺癌作用。该发现为研究抗前列腺癌药物提供了新的思路。油菜蜂花粉是中国特有的治疗前列腺增生的花粉类药物,疗效肯定。体内实验研究业已证实该药具有抑制前列腺腺上皮细胞增殖的作用。本研究旨在论证油菜蜂花粉中是否也存在具有抗前列腺癌作用的活性成分,并研究其相关的作用机制。
　　 免疫调节疗法是包括前列腺癌在内的恶性肿瘤治疗的重要组成部分,有研究证实在前列腺癌中常见Ⅰ型HLA的表达缺失,而Ⅰ型HLA与机体的免疫应答密切相关,故推测机体免疫功能异常可能是前列腺癌发生发展的重要原因之一。油菜蜂花粉的免疫调节活性已有报道,但其发挥活性作用的物质基础迄今未明,能否用于前列腺癌等肿瘤的免疫学治疗也尚未知晓。因此,确定其免疫调节活性的物质基础可能有益于抗前列腺癌药物的开发。
　　 鉴于以上两个方面的依据,本研究以油菜蜂花粉为研究对象,筛选其中具有抗前列腺癌或免疫调节作用的活性部位,并研究其可能的作用机制,为开发成分明确的抗前列腺癌新药提供物质基础和理论依据。
　　 第一部分油菜蜂花粉抗前列腺癌活性成分的筛选
　　 目的:采用体外培养的人肿瘤细胞株为模型,筛选油菜蜂花粉中具有抑制前列腺癌细胞体外增殖作用的活性成分。
　　 方法:以人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和雄激素敏感性前列腺癌细胞株LNCaP为模型,采用MTT法观察油菜蜂花粉不同溶剂提取物对前列腺癌细胞体外增殖的影响,以筛选具有抗前列腺癌细胞体外增殖作用的活性部位。在此基础上,进一步观察已筛选出的油菜蜂花粉活性部位对不同来源的、具有不同生物学特性的6种人肿瘤细胞株体外增殖的影响,以分析其作用特点。并采用化学显色法确定其化学类型归属。
　　 结果:通过观察油菜蜂花粉不同溶剂提取物对PC-3和LNCaP体外增殖的影响,确定油菜蜂花粉氯仿提取物的细分馏分(ChloroformextractfrompollenBrasMcacampestrisL,CPBC),具有明显的抑制PC-3和LNCaP体外增殖作用,IC50值分别为19.94±5.16和57.74±9.43μg/ml。进一步的实验表明该馏分对不同来源的人肿瘤细胞株表现出不同程度的抑制作用,IC50值分别为乳腺癌细胞MCF-770.51±1.27μg/ml、口腔表皮样癌细胞,KB86.53±10.56μg/ml、肝癌细胞HepG273.25±7.89μg/ml、卵巢癌细胞HO8910、慢性髓原白血病细胞K562及肺癌细胞A549IC50值均大于100μg/ml。提示CPBC对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3体外增殖有选择性抑制作用,对该细胞株呈现相对较强的体外抑瘤活性。
　　 CPBC的Liebermann-Burehard反应和Carr-price反应为阳性,表明该馏分主要由甾醇类物质组成。
　　 第二部分CPBC抑制PC-3细胞体外增殖作用机制研究及体内抗瘤活性观察
　　 目的:研究油菜蜂花粉提取物CPBC抑制激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3体外增殖的作用机制,并初步观察其体内抗肿瘤作用。
　　 方法:采用相差显微术、荧光显微术、透射电镜技术观察CPBC对PC-3细胞形态学的影响;流式细胞术定量分析凋亡现象和细胞周期的改变;Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax以及细胞周期相关蛋白Cde2和Cdc25c的表达变化。采用S180小鼠移植瘤模型观察其体内抗瘤活性。
　　 结果:CPBC可明显抑制PC-3细胞的体外增殖,其作用呈现明显的时效和量效关系。相差显微术、荧光显微术及透射电镜检测表明,CPBC可明显诱导PC-3细胞凋亡;流式细胞术分析表明,采用12.5、25和50μg/mlCPBC作用细胞24h后,随着浓度的升高,凋亡率相对于溶剂对照组的3.55±0.58%有明显升高,分别为7.47±2.22、18.45±5.22和37.82±4.39%;当采用50μg/mlCPBC处理细胞0、12、24和48h后,凋亡率分别为4.02±0.99、9.28±0.39、18.45±5.22和42.07±3.54.%,表明CPBC诱导PC-3细胞凋亡具有时效和量效关系。流式细胞术分析也表明CPBC可诱导PC-3细胞周期的G删期阻滞。Westernblot法的分析表明Bcl-2及Cdc25c的表达呈时间依赖性的下降,Bax及Cdc2的表达无明显变化。提示CPBC明显抑制PC-3细胞的体外增殖机制主要与其诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡相关。体内抗肿瘤实验也表明,采用62.5、125和250mg/kg的CPBC连续灌胃给药10日,对荷瘤小鼠体重无明显影响,但可明显抑制S180小鼠移植瘤的生长,其抑制率分别为13.11%、45.14%和.52.91%。
　　 第三部分油菜蜂花粉免疫调节作用活性成分筛选
　　 目的:研究油菜蜂花粉不同组分对正常小鼠脾细胞体外增殖的影响,以筛选油菜蜂花粉中具有免疫调节作用的活性成分。
　　 方法:以体外培养的正常小鼠脾细胞为模型,采用油菜蜂花粉不同组分提取物与脾细胞共孵育,观察其对ConA诱导脾细胞增殖的影响。
　　 结果:通过观察油菜蜂花粉不同组分与体外培养的正常小鼠脾细胞共孵育,分析其对ConA诱导脾细胞增殖的影响,确定蜂花粉多糖类物质(PolysccharidefrompollenBrassicacampestrisL,BCP)具有明显的促进ConA诱导的小鼠脾细胞体外增殖的作用。
　　 第四部分油菜蜂花粉多糖类组分BCP对S180小鼠移植瘤生长影响的实验研究
　　 目的:观察BCP对S180小鼠移植瘤生长的影响,并研究其可能的作用机制。
　　 方法:利用S180小鼠移植瘤模型,研究BCP灌胃给药对肿瘤生长的影响。并观察BCP灌胃后对荷瘤小鼠脾细胞体外增殖、NK细胞毒活性及脾细胞分泌IL-2和IFN-γ作用的影响。
　　 结果:BCP灌胃给药可明显抑制S180小鼠移植瘤的生长(P＜0.01),100、200和400mg/kg的BCP的抑制作用分别为14.81%、42.22%和33.33%,200和400mg/kg组荷瘤小鼠脾指数及胸腺指数均明显高于模型对照组(P＜0.01)。BCP灌胃后可明显促进ConA诱导的荷瘤小鼠脾细胞体外增殖、增强Nit细胞毒作用及促进脾细胞分泌。IL-2和IFN-γ(P＜0.0l或P＜0.05),其作用的量效关系均呈现马鞍型的特点。
　　 结论
　　 1.油菜蜂花粉氯仿提取物的甾醇馏分可选择性抑制激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3的体外增殖,IC50为19.94±5.16μg/ml;其作用机制与诱导PC-3细胞凋亡和细胞周期阻滞相关。
　　 2.油菜蜂花粉甾醇馏分可抑制S180小鼠移植瘤的生长,采用该馏分62.5、125和250mg/kg灌胃给药,其抑制率分别为13.11%、45.14%和52.91%。
　　 3.油菜蜂花粉多糖类提取物可抑制S180小鼠移植瘤的生长,采用该馏分100、200和400mg/kg灌胃给药,抑制率分别为14.81%、42.22%和33.33%,其作用机制与调节荷瘤鼠的免疫功能相关。
　　 4.油菜蜂花粉甾醇馏分及多糖馏分,可能具有开发为抗前列腺癌新药的前景。