腺病毒介导的蛋白聚糖Ⅱ基因转染对高糖环境下大鼠系膜细胞增殖，TGF-β1及细胞外基质的作用

摘要

研究背景和目的 糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见并发症之一，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因。高血糖环境中，细胞外基质(ECM)成分的堆积是糖尿病肾病发生和进展的最主要原因。越来越多的证据表明系膜细胞自分泌的转化生长因子-β1(TGF-β1)是高血糖对肾脏作用的重要中介。高糖环境中下调TGF-β1信号的治疗途径为我们提供了一个抑制DN发生、发展的途径。 蛋白聚糖Ⅱ，又称decorin(DCN)是一个37KD，分泌性蛋白聚糖。DCN可调节基本生物学功能，如基质组装，纤粘蛋白和血小板反应素介导的细胞粘附的调节。更重要的是DCN是TGF-β1的天然拮抗剂。有证据说明DCN通过其核心蛋白与TGF-β1结合可以直接中和其活性。 为更好地揭示在高血糖环境下，上调DCN对TGF-β1活性、细胞增殖、细胞外1基质堆积以及组织纤维化的抑制作用，并探讨DCN基因转染防治DN的可能性，本实验通过观察腺病毒介导大鼠蛋白聚糖Ⅱ基因(AD-DCN)转染对高糖培养的大鼠肾系膜细胞的影响，从细胞水平阐明DCN基因转染治疗糖尿病肾病的可能性。 实验设计和方法 1. 在AD293细胞中，体外扩增大鼠蛋白聚糖Ⅱ基因重组腺病毒(AD-DCN，由本实验组成员前期构建完成)和大鼠β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒(AD-Lacz，由国家重点实验室姚航平副研究员赠与)，并测定其MOI值。 2.大鼠肾系膜细胞细胞株(HBZY-1)培养：HBZY-1分5组培养，分别按照实验设计加入处理因子。高糖AD-Lacz病毒转染组(LACZ组)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培养，AD-Lacz以MOI=50感染，转染2小时后，更换不含病毒的培养液，为阴性转染对照组；高糖AD-DCN病毒转染组(DCN组)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培养，AD-DCN以MOI=50感染转染，2小时后更换不含病毒的培养液，为目的基因转染组；正常糖对照组(N组)：DMEM-L(含葡萄糖1000mg/L)培养，为正常对照组；高糖组(H组)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培养，为高糖对照组；高糖TGF-β1中和抗体对照组(H-anti-TGF组)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培养，TGF-β1中和抗体以3ng/ml的浓度中和，处理12小时换液。该组为阳性对照组。 在各种因子处理后培养5天。 3.MTT法测定系膜细胞的增殖：在培养第1天(各种因子处理后24小时)，第2天，第3天，第4天，第5天，分别用MTT法测定各组系膜细胞的增殖情况。 4.Westernblot法检测目的蛋白的表达：HBZY-1按上述分组培养，在培养第1天(各种因子处理后24小时)，第2天，第3天，第4天，第5天，收集培养上清和提取大鼠肾系膜细胞的总蛋白，测定样品蛋白总浓度，westernblot法测定上清DCN蛋白含量，系膜细胞TGF-β1，Ⅳ胶原(CollagenⅣ，C-Ⅳ)，纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)和层粘连蛋白(lamminin，LN)蛋白含量。同时测定β-actin蛋白作为内参。胶片用Epson公司的F-3200型扫描仪扫描，输入计算机。TOTALLAB(V2005)软件分析目的蛋白和β-actin蛋白的净光密度值。目的蛋白和β-actin净光密度的比值作为比较值。 5.统计分析：实验数据用均数±标准差表示，用Spss10.0软件统计，两样本间2的比较t检验，多个样本间的比较用单因素方差分析，P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著差异。 实验结果 1高糖对系膜细胞的作用：高糖促进系膜细胞的增殖，增殖作用在培养第1天出现，持续整个实验观察时点。高糖促进系膜细胞TGF-β1合成和DCN分泌，其作用在第1天出现，持续整个实验观察时点。高糖增加ECM的合成，C-Ⅳ合成增加在培养后24小时即出现，而FN、LN合成增加出现在第3天，均持续至第5天。 2AD-DCN对高糖环境下的系膜细胞的作用：AD-DCN抑制高糖引起的系膜细胞增殖，其抑制作用出现于第4，第5天，较TGF-β1中和抗体(抑制细胞增殖的作用出现在第1天)的作用缓慢，但第5天时两组的抑制作用相似(P＞0.05)。AD-DCN转染明显增加系膜细胞培养上清中DCN蛋白含量。在培养第3天，培养上清中DCN含量显著增加，分别是高糖组的141％和高糖Lacz组的134％，第5天培养上清中的DCN含量依然是5组中最高的，是高糖组的167％，是高糖Lacz组的143％。 AD-DCN转染对系膜细胞TGF-β1蛋白合成的抑制作用在转染的第3天出现，持续至实验第5天；AD-DCN对系膜细胞合成C-Ⅳ，FN，LN的抑制作用在转染的第3天出现，持续至第5天，与TGF-β1中和抗体的抑制作用趋势一致。在培养第5天，AD-DCN转染组、TGF-β1中和抗体组和正常对照组间TGF-β1、C-Ⅳ、FN和LN的蛋白表达量无统计学差异(P＞0.05)。 3AD-Lacz对高糖环境下的系膜细胞的作用：实验发现，转染的第1天对系膜细胞有轻微促增殖作用，并持续整个实验观察时段，但与高糖组比较无统计学差异。AD-Lacz对系膜细胞DCN蛋白合成无显著影响，与高糖组比较无统计学差异。AD-Lacz转染后第1天可见系膜细胞TGF-β1、C-Ⅳ、FN和LN合成有轻度增加，与高糖组比较，有统计学差异(p＜0.05)，第3天，第5天这种影响已不明显，与高糖组比较，没有统计学差异(P＞0.05)。 结论 1高糖促进大鼠肾系膜细胞的增殖，促进DCN、TGF-β1、和细胞外基质成分C-Ⅳ、FN和LN蛋白合成。 2但白聚糖Ⅱ重组腺病毒载体可在大鼠肾系膜细胞中高效表达目的蛋白DCN。 3腺病毒介导的DCN基因转染可明显抑制高糖环境下大鼠肾系膜细胞的增殖，抑制高糖刺激的TGF-β1，C-Ⅳ，FN，LN蛋白的表达。其对大鼠系膜细胞增殖及TGF-β1、C-Ⅳ、FN和LN蛋白表达的抑制作用与TGF-β1中和抗体相似。

目录

前言

研究方法

研究结果

讨论

结论

参考文献

综述 糖尿病肾病基因治疗

致谢