肠淋巴液致休克大鼠多器官损伤的作用及机制研究

摘要

失血性休克(hemorrhagicshock)是临床常见急症，在失血性休克的发展过程中，会引起肠道屏障功能障碍和肠内细菌/内毒素移位(bacteria/endotoxintranslocation，BET)，导致肠源性感染，进而引起肺、肝、心、肾等多个器官的功能改变，诱发多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)，严重威胁着人类生命，常常导致病人死亡。失血性休克致器官损伤的发生机制可能与休克引起失控的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)以及肠源性内毒素血症等环节有关。淋巴学是循环系统研究的薄弱领域，长期以来，一直认为淋巴途径是血液循环回流的辅助部分。作者多年的研究工作发现，淋巴微循环与休克的发生、发展及转归关系密切，结扎肠系膜淋巴管阻断肠淋巴液回流，可减轻二次打击大鼠的器官功能障碍，降低炎症反应. 目的本研究通过整体动物实验，观察肠系膜淋巴管结扎阻断淋巴回流对失血性休克大鼠多器官的损伤作用，从器官形态、功能及自由基(FR)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素-6(IL-6)的变化，探讨其发病学机制；同时建立大鼠肺微血管内皮细胞(pulmonarymicro-vascularendothelialcells，PMVEC)的原代培养技术，在离体条件下研究休克淋巴液对PMVEC的损伤作用，观察休克淋巴液对PMVEC的形态、代谢活力、增殖与凋亡、凋亡相关基因及炎症介质基因表达的影响，阐明休克淋巴液对多器官损伤的细胞分子机制，进一步揭示肠淋巴液回流在休克发病学中的作用及意义。 方法1)大鼠重症失血性休克模型的复制大鼠肌注2％的戊巴比妥钠(50mg/kg)全身麻醉，无菌手术，行右侧颈总动脉和左侧颈静脉插管，舌静脉注射0.5％肝素(1ml/kg)，全身抗凝。 2)存活率观察30只Wistar雄性大鼠，均分为假手术组、休克组、结扎组3组(均n=10)。休克组及结扎组按“方法1)”复制失血性休克模型。输液复苏后行腹部手术，结扎组行肠系膜淋巴管结扎术；休克组及假手术组仅在肠系膜淋巴管下穿线，不结扎。 3)器官功能及形态学观察18只Wistar雄性大鼠，分为假手术组、休克组、结扎组3组(均n=6)，用于器官功能及形态学观察。按“方法1)、2)”复制失血性休克模型，3组动物分别于休克输液复苏后(或相当)6h，再次麻醉，颈总动脉插管，放血，制备血清。全自动血气酸碱分析仪检测动脉血pH、PaO2、PaCO2等反映肺功能的指标； 4)组织匀浆制备及炎症介质检测78只大鼠分为假手术组、休克组、结扎组，用于不同时间点的组织匀浆制备及炎症介质检测。按“方法1)、2)”复制失血性休克模型，休克组于维持低血压90min后、输液复苏后0h，休克组及结扎组于输液复苏后1h、3h、6h、12h、24h等时间点(各时间点n=6)，假手术组于完成假手术后，分别处死动物。 5)PMVEC的原代培养70～100g的Wistar雄性大鼠，戊巴比妥钠全身麻醉后，75％的酒精浸泡消毒。开胸取出肺脏，置入预冷的Hank's液中，除去残留血液，小心将肺的边缘组织剪成1mm3大小的组3织小块，贴入无菌的培养瓶中，经培养箱固化2h后，加入DMEM培养基进行PMVEC的原代培养。当细胞融合后，经胰蛋白酶消化后进行传代培养，应用第三代PMVEC进行本研究。 6)休克淋巴液的引流复制大鼠失血性休克模型，部分大鼠行肠系膜淋巴管插管，引流重症休克期肠系膜淋巴液，时间为2h左右，量为0.5ml左右，离心取上清液，储存于-80℃冰箱内备用；其它大鼠行门静脉插管，制备休克门静脉血浆。此外，应用正常雄性大鼠同法肠系膜淋巴管插管或门静脉插管，制备正常淋巴液及门静脉血浆，作为对照。 7)PMVEC形态、增殖周期的观察实验分为6组：A组(10％胎牛血清组)：培养液为DMEM+10％胎牛血清；B组(正常淋巴液组)：培养液为DMEM+正常淋巴液；C组(休克淋巴液组)：培养液为DMEM+休克淋巴液；D组(正常血浆组)：培养液为DMEM+正常血浆；E组(休克血浆组)：培养液为DMEM+休克血浆；F组(无血清对照组)：培养液为DMEM。 8)休克淋巴液对PMVEC凋亡相关基因及炎症介质基因表达的影响4％终浓度的休克淋巴液与PMVEC孵育6h后，经胰蛋白酶消化，制备细胞悬液。用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，一步法提取细胞总RNA，逆转录出的cDNA，-20℃保存备用。按AMV一步法RT-PCR试剂盒说明，优化实验条件，用β-actin作为内参照，分别检测PMVEC的凋亡相关基因bcl-2、bax、Fas、FasL、炎症介质TNFα、IL-6、iNOS以及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的mRNA表达；PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照后进行密度扫描，计算待测基因与β-actin的灰度值比表示待测基因的相对表达量。 9)休克淋巴液中内毒素、TNFα、IL-6检测24只Wistar雄性大鼠，按“方法1)”复制重症失血性休克模型，按“方法6)”进行休克淋巴液、休克血浆、正常淋巴液、正常血浆的引流(均n=6)，封存于无热原玻璃管中，4-80℃冷冻保存；采用改良的偶氮基质显色鲎试验(LAL)定量法检测内毒素水平。同时，另取部分引流的休克淋巴液、休克血浆、正常淋巴液、正常血浆按“方法3)”检测TNFα、IL-6的含量。 结果1)24h存活率观察，休克组大鼠显著低于假手术组与结扎组(P＜0.05)。血气分析，休克组与假手术组、结扎组及实验前比较，动脉血pH、PaO2显著降低、PaCO2明显升高(P＜0.01，P＜0.05)；血清生化指标检测，休克组大鼠血清AST、ALT、BUN、Cre、LDH-1、CK-MB水平显著高于实验前、假手术组和结扎组(P＜0.01)。 2)结扎肠系膜淋巴管阻断淋巴液回流可减少器官组织匀浆促炎细胞因子及介质的生成与释放。失血性休克大鼠于输液复苏后不同时间点的肺、肝、心、肾匀浆的MDA、NO含量、NOS、MPO活性、TNFα、IL-6水平均显著高于假手术组，且SOD活性显著低于假手术组(P＜0.01，P＜0.05)。结扎组大鼠于输液复苏行肠系膜淋巴管结扎阻断肠淋巴液回流后，不同器官在不同时间点肺、肝、心、肾等重要器官组织匀浆的MDA、NO含量、NOS、MPO活性、TNFα、IL-6水平虽显著高于假手术组，且SOD活性显著低于假手术组(P＜0.01，P＜0.05)； 3)休克淋巴液对PMVEC具有损伤作用。以不同终浓度的休克淋巴液、休克血浆、正常淋巴液、正常血浆等与PMVEC孵育后，随着休克淋巴液浓度的增加以及作用时间的延长，损伤作用逐渐增强，在一定范围内，呈时间、剂量效应关系。4％的休克淋巴液作用PMVEC54h，部分细胞收缩、变圆，脱落细胞增加，10％终浓度的休克淋巴液作用12h全部细胞几乎均破碎成片状；休克血浆对PMVEC也有一定的损伤作用，但作用明显弱于休克淋巴液。流式细胞仪检测结果显示：4％休克淋巴液作用PMVEC4h后，出现亚二倍体凋亡峰，休克淋巴液诱导的凋亡的百分率为(35.2±1.4)％，明显高于其它各组(P＜0.01)；细胞周期分析显示，G0/G1期细胞比值增大，S、G2/M期细胞比值下降。结果提示休克淋巴液的抑制大鼠PMVEC增殖，促进细胞凋亡、坏死的作用。 4)以4％终浓度的休克淋巴液、休克血浆与PMVEC孵育6h，与其它各组比较，促凋亡相关基因bax、Fas、FasL以及炎症介质TNFα、IL-6、iNOS的mRNA表达显著增强，抑制凋亡基因bcl-2以及VEGF的mRNA表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)；而休克淋巴液组的bax、Fas、FasL、TNFα、IL-6、iNOS的mRNA表达显著高于休克血浆组，且bcl-2、VEGF的mRNA表达显著低于休克血浆组(P＜0.01)。对休克淋巴液、休克血浆、正常淋巴液、正常血浆毒性物质检测的结果显示：休克淋巴液中内毒素、TNFα、IL-6含量显著高于休克血浆、正常淋巴液及正常血浆(P＜0.01)。结果提示，休克淋巴液对PMVEC的损伤作用与上调促炎介质和促凋亡基因表达、下调抑凋亡基因及VEGF表达以及休克淋巴液中高浓度的内毒素、TNFα、IL-6有关。 结论1)结扎肠系膜淋巴管，阻断休克大鼠的淋巴液回流，可提高失血性休克大鼠的存活率，改善器官功能及组织学损伤，其机制与减少肠源性内毒素移位、降低自由基损伤、NO、TNFα、IL-6的释放及表达、减少中性粒细胞扣押有关。 2)休克淋巴液具有损伤PMVEC的作用，且损伤作用显著强于休克血浆，其机制与休克淋巴液诱导PMVEC凋亡、上调炎症介质TNFα、IL-6、iNOSmRNA表达、提升促凋亡基因bax、Fas、FasLmRNA表达、下调抑凋亡基因bcl-2以及VEGFmRNA的表达有关，同时，也与休克淋巴液中高浓度的内毒素、TNFα、IL-6等致炎因子有关。 3)研究结果提示重症休克大鼠肠系膜淋巴液回流在其发病学中具有重要作用；以淋巴6为靶向，阻断淋巴液回流，可为休克的防治及减轻休克后多器官损伤开辟新途径。

目录

缩略词表

前 言

第一部分肠系膜淋巴管结扎对休克大鼠多器官功能形态及存活率的影响

第二部分肠系膜淋巴管结扎干预休克大鼠多器官损伤的机制

第三部分休克淋巴液对肺微血管内皮细胞的损伤作用

第四部分休克淋巴液损伤肺微血管内皮细胞的分子机制

结 论

参考文献

综述 休克致器官损伤的淋巴机制研究进展

致 谢

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