肠-淋巴液途径在大鼠脓毒症发病机制中的作用及淋巴液差异蛋白质组学研究

摘要

脓毒症患者发生远隔器官功能障碍的机制尚不明确，针对脓毒症还没有确切有效的治疗药物。近年来，“肠-淋巴液”假说在休克、肠缺血/再灌注损伤、急性胰腺炎等动物模型上得到验证，确认了肠淋巴液途径在远隔器官损伤中的作用，并应用组学技术找到了休克和急性胰腺炎大鼠淋巴液中的差异蛋白质。然而遗憾的是，作为最能模拟临床过程的脓毒症模型之一，盲肠结扎并穿孔(CLP)模型出现在肠淋巴液研究中的频率相对低很多。本研究旨在探讨肠淋巴液途径在CLP大鼠继发急性肺损伤中有无作用以及是否起主导作用，并寻找CLP大鼠胸导管淋巴液中有意义的差异蛋白质，为继续深入研究脓毒症的早期标志物和治疗靶点打下基础。
　　 第一部分、胸导管淋巴液回流在盲肠结扎并穿孔大鼠急性肺损伤中的作用
　　 目的:利用科赫法则逐一对肠淋巴液途径在CLP大鼠继发急性肺损伤发病机制中的作用进行验证，同时从细胞因子水平评价淋巴液对CLP继发脓毒症的影响。
　　 方法:1、结扎胸导管、阻断淋巴液回流，阻止淋巴液与大鼠肺组织的接触，观察CLP大鼠生存率，检测肺、肝、肾组织匀浆肺髓过氧化物酶(MPO)含量变化;2、从CLP大鼠术后6h和24h分离出来的淋巴液，再分别注射到正常大鼠体内，检测肺干湿重比、组织病理和肺组织匀浆MPO含量;3、CLP术后不同时间点分别留取淋巴液标本，检测其中促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10含量变化。
　　 结果:1、预先结扎胸导管(TDL)组CLP大鼠术后10天生存率显著高于单纯CLP处理组(90％vs.40％，p=0.029); TDL+CLP组大鼠较单纯CLP组肺组织病理损伤轻;TDL+CLP组大鼠肺MPO含量高于CLP组（102.8±11.41vs.85.67±35.21 ng/mg Pro，p＜0.01），两者都远远高于对照组(p＜0.01)。2、注射 CLP-6h淋巴液组大鼠肺组织病变最重，注射CLP-24h淋巴液组肺组织病理改变轻;注射CLP-6h淋巴液组大鼠肺MPO含量（81.96±30.63 ng/mg Pro）远远高于其他各组(p＜0.05)，注射CLP-24h淋巴液组大鼠肺MPO含量(34.84±13.91 ng/mg Pro)与对照组相比改变不大。3、淋巴液中IL-6和IL-10浓度比血液中的浓度高，CLP组高于假手术组，同时段的IL-6比IL-10浓度高。淋巴液中的IL-6、IL-10浓度在18h和24h均明显降低，而血液中的IL-6、IL-10浓度在18h和24h仍有升高趋势。
　　 结论:CLP大鼠淋巴液含有能诱发急性肺损伤的物质，并是血液中炎性细胞因子的来源之一，肠淋巴液途径在CLP大鼠脓毒症继发远隔器官损伤的发病机制中起重要作用。
　　 第二部分、CLP大鼠淋巴液蛋白质组学及生物信息学分析
　　 目的:针对CLP术后早期(6h)和后期(24h)大鼠胸导管淋巴液进行差异蛋白质组学研究，找到CLP特有的、以及CLP不同病程时段动态变化的差异蛋白质，并通过生物信息学技术分析这些差异蛋白质相互之间的关系，推断其中某些特定蛋白质在脓毒症发病机制中可能起的作用。
　　 方法:采用iTRAQ技术对CLP大鼠胸导管淋巴液的蛋白质组进行定量分析，利用统计学方法筛选差异表达的蛋白质，对差异蛋白质进行Gene ontology、Pathway以及Network分析。
　　 结果:
　　 1、共鉴定到有定量信息的蛋白质984个，其中158个为显著性差异蛋白质（特征信息完整的有111个）。
　　 2、差异蛋白质总共对应24个信号通路、29个代谢通路和10个疾病通路，有明确分子功能的蛋白质以结合类蛋白质占多数，其次是酶、激酶和酶抑制剂。
　　 3、差异蛋白质内部构建了基因网络关系图，158个蛋白质的基因都有直接或间接的联系。
　　 4、通过生物信息学分析，以基因网络图中的5个蛋白质再次构建网络关系图。
　　 结论:CLP大鼠胸导管淋巴液与正常大鼠相比有多个差异蛋白质，其中某些蛋白质有可能成为脓毒症器官功能损伤的早期标志物或脓毒症的治疗靶点。
　　

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 胸导管淋巴液回流在盲肠结扎并穿孔大鼠性肺损伤中的作用

第一章 胸导管结扎对盲肠结扎并穿孔大鼠预后和脏器损伤的影响

第二章 正常大鼠注射CLP术后大鼠淋巴液的效应

第三章 CLP大鼠淋巴液IL-6和IL-10随时间变化情况

小结

第二部分 CLP大鼠淋巴液蛋白质组学及生物信息学分析

背景

第一章 iTRAQ法对CLP术后大鼠淋巴液进行差异蛋白质组学研究

第二章 差异蛋白质的生物信息学分析

总结

文献综述

参考文献

附录1 蛋白质鉴定定量结果

附录2 淋巴液的蛋白质鉴定结果

附录3 CLP淋巴液的差异蛋白质

在读期间投稿论文和参加科研情况说明

致谢