尼克酰胺N-甲基化酶表达载体的构建、表达产物的分离纯化、及多克隆抗体的制备

摘要

尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT,EC2.1.1.1)是S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)依赖的胞质酶，它以SAM为甲基供体，催化尼克酰胺和其他吡啶类物质形成吡啶盐类物质。据文献报道，NMMT酶蛋白含量和mRNA水平在多种疾病中的明显增高，例如肾癌、帕金森病、甲状腺癌等。在肾透明细胞癌中，NNMT基因表达是正常肾组织和其他亚型肾癌表达的三倍以上。在甲状腺癌中，几乎所有的乳头状甲状腺癌的NNMT蛋白及其mRNA水平都明显增高，但在滤泡状、未分化、髓样甲状腺癌中却不明显。在帕金森病人的脑脊液中，NNMT蛋白含量明显高于正常对照组。目前检测NNMT的方法主要有放射性同位素酶化学法，免疫印迹，PROTEOMEX分析，高密度寡核苷酸微阵法等。这些方法存在易污染或费用昂贵或同位素废物处理等缺点不适应用于临床诊断。本实验的目的在于构建NNMT的表达载体，表达正确的人NNMT蛋白，并制备其多克隆抗体，为下一步制备单克隆抗体及建立检测NNMT的ELISA法奠定基础。 目的利用pGEX-4T-2系统构建重组尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT)表达载体，诱导表达并对表达产物进行分离纯化，制备多克隆抗体及纯化抗体。 方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMTcDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点。从人肝脏组织中提取总RNA，进行RT-PCR获得NNMT基因。经T-A克隆至PGEM-T-Easy载体，经过BamHI/XhoI双酶切与同样经过双酶切的pGEX-4T-2连接。重组质粒pGEX-4T-2/NNMT转化至大肠杆菌BL-21-STAR(DE3)，重组菌经异丙基-β-D-硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达，用GlutathioneSepharose4B亲和层析制备融合蛋白GST-NNMT。通过DNA测序来证实质粒pGEX-4T-2/NNMT的正确性，SDS-PAGE电泳以及Western-blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。纯化后的融合蛋白作为抗原按常规方法免疫家兔，十周后收集兔血清，SAS沉淀法纯化IgG，用双向琼脂扩散和ELISA法测定多抗效价。 结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到pGEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒pGEX-4T-2/NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4.5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。免疫兔血清用双向琼脂扩散检测抗血清的效价达到1∶16,用饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化IgG后，用ELISA法测抗GST-NNMT多克隆抗体效价约为103。结果表明，成功地利用基因重组技术制备了NNMT，制备分离纯化其多克隆抗体，为制备NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。 结论1.成功构建表达质粒pGEX-4T-2/NNMT2.表达质粒能体外表达融合蛋白GST-NNMT，且表达产物主要存在于可溶性上清液中。 3.制备出抗GST-NNMT的多克隆抗体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

第一章研究背景

第二章实验材料和方法

第三章实验结果

第四章讨论

结论

参考文献

综述 人尼克酰胺N-甲基化酶——一种新的生物标志物

攻读硕士学位期间完成与发表的论文

致谢