多杀性巴氏杆菌跨膜输出蛋白基因选择克隆载体的构建和应用

摘要

在己构建pMBL载体的基础上，参照Lac启动子序列设计引物，从质粒puC18上扩增出260bp大小的片段，定向克隆入pMBL载体，获得含可调控启动子(Plac)的跨膜输出蛋白基因选择克隆载体pMB-Lac，大小为3.72kb。参照Ara启动子序列设计引物，从Ecoli基因组上扩增出阿拉伯糖启动子及其调控基因，定向克隆入pMBL载体，构建成另一个跨膜输出蛋白基因选择克隆载体pMB-Ara，大小为4.74kb。经酶切鉴定和测序，证明构建的载体与预期设计的一致。 为证明pMB-Lac/pMB-Ara 2个跨膜输出蛋白基因选择克隆载体的有效性，从质粒pBR322上PCR扩增缺失启动子的已知跨膜输出蛋白基因---四环素抗性基因片段(APTet，315bp)，EcoR Ⅰ/BamHⅠ双酶切末端，分别与用EcoR Ⅰ/BamHⅠ、EcoR Ⅰ/Bgl Ⅱ、EcoR Ⅰ/Bcl Ⅰ双酶切的载体连接。经Kan+Amp+IPTG/Kan+Amp+Arabinose平板筛选，在EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ双酶切载体(+2位)的连接产物中获得阳性转化子。经酶切和测序确认△P Tet基因已以阅读框对位的方式插入，Lac/Ara启动子驱动了△P Tet基因和报告基因(△P△SP Amp)的融合表达和跨膜分泌。 为评估载体骨架上MCS上游启动子或潜在的启动子对克隆基因的漏表达影响，将△P Tet基因片段克隆到不含启动子的原始质粒pMBL，构建pMBL △PTet阴性对照质粒，结果转化子在Kan平板中生长，而在Amp+Kan平板上无论是否诱导或使用何种诱导剂诱导仅在Amp 16(浓度单位为mg/L)时有少量生长。为探讨pMB-Lac/pMB-Ara 2个载体中的Lac和Ara启动子的可调控范围、漏表达的程度及诱导的最适条件，对构建的pMB-Lac△PTet、pMB-Ara△PTet载体的转化子进行不同诱导剂及浓度的诱导表达，并使用不同的Amp浓度进行筛选，为排除△PTet在去除启动子时对其SD序列可能造成的破坏，用T7-SD序列直接与Tet基因编码区拼接，构建了pMB-L,acAPT7-Tet质粒，并与pMB-Lac△PTet进行对照。结果pMB-Lac△PTet和。pMB-Lac△PT7-Tet的转化子经1.5mM的IPTG诱导在Ampl6、32、64平板中均有一定程度的生长，相比较相同条件下带T7-SD序列的转化菌生长优于带Tet-SD序列的转化菌。pMB-Ara△PTet转化子在0.5％ 的阿拉伯糖诱导下在Amp 16、32、64、128平板上均生长良好，但细菌生长速度慢于在对照平板上的生长速度；应用不同浓度的阿拉伯糖进行诱导，结果用1.25％的浓度诱导时，细菌在Amp50平板上与在对照的Kan平板上菌落数相近；而用0.3-1.25％和1.25.10％浓度的阿拉伯糖诱导时，细菌菌落数均较1.25％的浓度诱导时低。应用无抗性液体培养基连续转接传代10次和20次，分析了构建的重组质粒的遗传稳定性，结果显示质粒丢失不明显，质粒骨架稳定。进一步选择pMB-Ma，载体试用于多杀性巴氏杆菌C48-19菌株的外膜蛋白基因的克隆。提取细菌的基因组DNA，用Sau 3A Ⅰ部分酶切，回收800bp-1kb的部分酶切片段，并与用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ/BgkⅡ、EcoR Ⅰ/BclⅠ双酶切的pMB-Ara载体连接，转化产物分别用Amp+Kan平板和Amp+Kab+1.25％abinose平板筛选。于Amp+Kan平板上挑取克隆子，PCR扩增出插入的膜蛋白基因片段，并混合，标记为探针，与Amp+Kan+1.25％arabinose平板上获得的克隆子杂交，筛选到5个表达差异的克隆(为62<'＃>、88<'＃>、89<'＃>、107<'＃>和108<'＃>克隆)。可诱导性验证结果进一步证实了88＃克隆在Amp+Kan平板中不生长而在Amp+Kan+1.25％arbinose平板中生长，推断88<'＃>克隆的Amp活性是由载体所带的Ma启动子所驱动的，而19<'＃>克隆在两种平板中均能生长，表现为组成型表达的特点。 序列测定、BLAST同源查找以及SigalP信号肽预测等结果显示，88<'＃>克隆外源插入片段全长827bp，含有完整的启动子序列结构，且与多杀性巴氏杆菌Pm70的atr1基因高度同源，推测该基因的启动子为E.coli中沉默的启动子，可能只在特殊诱导条件下才开放。而19<'＃>克隆子克隆834bp的基因片段，对应于一功能未知的unknown基因(PM0741基因，784aa)，为组成型表达的跨膜蛋白基因。该载体系统能有效地用于病原菌膜蛋白基因的选择克隆。 该载体系统的建立，为进一步研究多杀性巴氏杆菌毒力、免疫原性等相关的跨膜蛋白及其基因的功能和表达调控等奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章文献综述

1多杀性巴氏杆菌及其生物特性研究

1.1多杀性巴氏杆菌血清型及致病性

1.2多杀性巴氏杆菌交叉保护因子

1.3多杀性巴氏杆菌主要外膜蛋白

2基于多杀性巴氏杆菌基因组的研究方法

2.1基因芯片

2.2限制性内切酶分析（REA）

2.3核糖体分型

2.4脉冲场凝胶电泳(PFGE)

2.5 DNA指纹技术

2.6其他基因组学研究方法

3膜蛋白的跨膜分泌与选择克隆

3.1膜蛋白的跨膜与分泌

3.2用于跨膜分泌与膜蛋白拓扑结构研究的方法

3.3报告基因的种类和特性

3.4有关报告基因融合方面的应用研究

4本研究的工作基础、目的、意义和主要内容

4.1本研究的工作基础

4.2本研究的目的、意义和主要内容

第二章跨膜输出蛋白基因选择克隆载体的构建

1材料

2方法

3结果

3.1 pMB-Lac载体的构建和分析

3.2 Ara启动子的扩增和BamH I位点突变

3.3 pMB-Ara载体的构建

3.4 pMB-Ara载体序列和结构分析

4讨论

第三章载体pMB-Lac/pMB-Ara调控性验证

1材料

2方法

3结果

3.1△P Tet/△P T7-Tet基因的扩增

3.2 pMB-Lac△P Tet和pMB-Lac△P T7-Tet重组质粒的构建

3.3 pMBL△PTet和pMB-Ara△PTet重组质粒的构建

3.4 pMB-Lac载体调控性验证

3.5 pMB-Ara载体验证

3.6重组质粒稳定性分析

4讨论

第四章多杀性巴氏杆菌跨膜蛋白基因的克隆和分析

1材料

2方法

3结果

3.1 C48-19基因组部分酶切片段的回收

3.2转化重组子的筛选和PCR扩增插入基因片段

3.3杂交分析差异表达的膜蛋白基因片段

3.4 PCR和酶切鉴定筛选获得的克隆子

3.5 19#和88#阳性克隆诱导生长特性验证

3.6膜蛋白基因片段的测序和分析

3.7编码肽链的信号肽预测分析

4讨论

本研究的主要结论和创新点

参考文献