雷公藤内酯醇对人多发性骨髓瘤耐药细胞株MM.1R的作用研究

摘要

本实验旨在进一步研究雷公藤内酯醇(triptolide，TPL)对人多发性骨髓瘤耐地塞米松细胞株MM.1R(dexamethasone，Dex)及敏感株MM.1S的作用并初步探讨可能的作用机制，为临床应用提供理论依据。 研究方法： 1、采用MTT比色法检测TPL对人MM细胞株MM.1R和MM.1S体外生长的抑制作用。 2、瑞氏—姬姆萨(Wright-Giemsa)染色，油镜下观察细胞形态。 3、应用流式细胞仪，AnnexinV和PI双染色，周期分析检测细胞凋亡。 4、western-blot法检测TPL对MM.1细胞Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1，和Bax表达水平的影响。 5、采用MTT比色法检测TPL作用下，MM.1细胞株对Dex和蛋白酶体抑制剂PS-341的敏感性变化。 研究结果： 1.TPL抑制MM.1细胞的生长，呈浓度依赖性：MTT比色法检测结果显示，1.0-16ng/mlTPL处理MM.1细胞24h、48h、72h，能够明显抑制细胞增殖，各组间差异显著(P值均小于0.001)。且生长抑制率与药物作用浓度呈正相关(P＜0.001)。TPL处理细胞24h、48h、72h后，MM.1S和MM.1R的IC50分别各为5.056ng/ml；2.468ng/ml；1.935ng/ml和9.879ng/ml；4.914ng/ml；3.635ng/ml。 2.TPL诱导MM.1细胞凋亡，呈浓度依赖性：采用瑞氏—姬姆萨染色，油镜下观察TPL作用前后MM.1细胞形态学变化，结果显示，5-10ng/ml的TPL处理24小时后，MM.1细胞出现典型的凋亡形态学特征，如胞浆空泡化，细胞体积缩小，细胞核染色质凝聚、边缘化，形成新月型核或环形核，细胞核碎裂，凋亡小体形成等。以流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量、亚二倍体及磷脂酰丝氨酸(PS)转位。PI的DNA染色结果显示，0-10ng/mlTPL作用24hr，亚二倍体凋亡细胞百分数分别为：1.63％，8.84％，17.05％(MM.1S)和0，3.61％，10.77％(MM.1R)。细胞凋亡率与药物作用浓度正相关：rMM.1S=0.999，rMM.1R=0.982，P值均小于0.01。AnnexinV-PI双标记法结果显示：MM.1S细胞以5ng/ml，10ng/mlTPL处理16hr，早期凋亡细胞百分数分别为：16.31％，23.63％(空白对照组为2.18％)，细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关(r=0.984，P＜0.01)；MM.1R细胞以5ng/ml，10ng/mlTPL处理16hr，早期凋亡细胞百分数分别为：9.35％，16.43％(空白对照组为1.56％)，细胞凋亡率与药物作用浓度正相关(r=0.999，P＜0.01)。 3.TPL对MM.1细胞Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bax表达水平的影响：10-20ng/mlTPL作用MM.1S和MM.1R细胞12h后，Bcl-2、Mcl-1表达水平显著下调，Bax表达水平上调，光密度扫描示Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达水平与TPL作用浓度存在负相关，Bax的蛋白表达水平与TPL作用浓度呈正相关。提示TPL可能通过改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例，促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放诱导骨髓瘤细胞凋亡的。 4.TPL增强MM.1R和MM.1S细胞对地塞米松和蛋白酶体抑制剂PS-341的敏感性：分别单独及联合以TPL0-5.0ng，Dex0-1.0μg或PS-3410.001-0.01μM处理MM.1R和MM.1S细胞24小时，MTT比色法测定抑制率，结果显示，在一定浓度范围内，TPL与Dex或PS-341联用效果优于单用，且细胞抑制率与药物浓度呈正相关。 研究结论： 1、在体外，TPL可直接抑制MM细胞株MM.1细胞的生长，并呈浓度依赖性； 2、5-10ng/mlTPL处理一定时间后可明显诱导MM.1细胞的凋亡，并呈浓度依赖性； 3、TPL能下调Bcl-2和Mcl-1蛋白的表达水平，同时上调Bax蛋白的表达水平，改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的表达比例，诱导细胞凋亡； 4、TPL能增强MM.1R和MM.1S对地塞米松和PS-341的敏感性，在一定浓度范围内与地塞米松和PS-341有协同作用。

目录

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

综述 多发性骨髓瘤细胞的抗凋亡机制研究进展

致 谢