α-Gal抗原模拟表位分析及模拟肽活性鉴定

摘要

阻断人天然抗α-Gal抗体与猪细胞表面大量表达的α-Gal抗原是异种器官移植成功的一个重要前提。在异种器官移植中，这些α-Gal抗原可与人天然抗α-Gal抗体诱发超急排斥反应。为找到能够运用于异种器官移植中的特异性结合抗体的多肽，对两种肽库进行了亲和筛选：线性7肽库和C7C肽库。采用抗B型血单克隆抗体为靶分子，经过4轮筛选，随机挑取了160个噬菌体克隆，经ELISA实验检验22个克隆特异地结合抗体。DNA测序结果显示，这些筛选出来的多肽具有高度同源序列PT和STL。水苏糖竞争实验证明这些多肽都特异性地结合于α-Gal抗原表位结合位点。血凝实验表明8个多肽可以竞争性抑制由人天然抗α-Gal抗体诱发的凝血反应。这些结果说明筛选出来的多肽能够在空间构象上模拟α-Gal抗原表位。这些α-Gal抗原表位模拟肽所提供的分子结构信息为将来进一步开发抗异种器官移植超急排斥反应的药物提供了基础。 1噬菌体展示肽库的筛选以抗B型血单克隆抗体包被酶标板，5％牛血清白蛋白37℃封闭2小时，TBS洗板3次，加入噬菌体肽库室温反应1小时，含0.1％Tween-20的TBS洗板10次，每孔加入酸洗脱液洗脱10分钟，然后用中和液中和。将洗脱的噬菌体感染感受态E.coliER2738扩增，纯化，进行下一轮的筛选。噬菌体线性7肽库和C7C肽库经过4轮筛选，各出现不同程度的富集现象。 2酶联免疫吸附实验筛选阳性噬菌体第4轮洗脱下来的噬菌体感染E.coliER2738，从平板中随机挑取了160个噬菌斑，制备单克隆噬菌体溶液。在酶标板中包被抗B型血单克隆抗体，加入单克隆噬菌体溶液(2×1012TU)反应1小时，含0.1％Tween20的TBS洗板6次，加入辣根过氧化物酶标记抗M13抗体，结合1小时，用含0.1％Tween20的TBS洗板6次，加入TMB进行显色，通过ELISA实验比较它们与抗体和BSA的不同结合反应，筛选特异性结合抗体而非BSA的阳性克隆。我们从线性7肽库中筛选出了16个阳性克隆，而从C7C肽库中只筛选出6个阳性克隆。 3DNA测序对筛选得到的阳性噬菌体提取单链DNA，送上海生工进行测序，引物为5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。根据噬菌体单链DNA的测序结果，我们推测出筛选的阳性噬菌体表面展示的多肽氨基酸序列。线性七肽与环肽之间存在共同的保守序列PT。 4水苏糖竞争性ELISA实验在酶标板中包被抗B型血单克隆抗体，加入阳性噬菌体和不同浓度的水苏糖混合反应1小时，另设不加水苏糖的阳性噬菌体液作为空白对照。用含0.1％Tween20的TBS洗板6次，加入辣根过氧化物酶标记抗M13抗体，结合1小时，用含0.1％Tween20的TBS洗板6次，TMB进行显色，用酶标仪测定吸光度。计算抑制率按照公式：[A450(-s)-A450(+s)]/A450(-s)×100％，A450(-s)为未加水苏糖的吸光度，A450(+s)为加入水苏糖的吸光度。水苏糖具有和α-Gal抗原极其相似的分子结构，能特异性地结合于α-Gal抗原表位结合位点，因此我们进一步通过水苏糖竞争性抑制试验来检验筛选的多肽与抗α-Gal抗体的结合位点。结果显示水苏糖能有效的抑制多肽与抗体的结合，说明水苏糖与多肽结合于抗体的同一位置，即α-Gal抗原表位结合位点。 5DTT还原实验在酶标板中包被抗B型血单克隆抗体。将DTT加入噬菌体溶液中，至终浓度为2mM，反应1小时。将未加DTT的噬菌体溶液作为对照。ELISA检验OD450的变化。二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂打开二硫键，使多肽有环状变为线性。通过ELISA我们比较了使用DTT前后多肽与抗体结合情况的变化。对于线性7肽库中展示的多肽，加入DTT前后多肽与抗体的亲和力没有明显的变化。而当C7C肽库中展示的多肽的二硫键被打开时，其亲和力有不同程度的下降，表明对于从C7C肽库中筛选的多肽，其环状结构对它们形成适宜构象与抗体有效结合是必需的。 6多肽的合成根据由测定的DNA推导出来的多肽序列，由杭州中肽生化有限公司采用固相法合成。纯度经HPLC检验达到70％以上，分子量经质谱测定符合理论大小。 7阳性噬菌体和多肽对猪红细胞凝集抑制实验将猪红细胞用PBS洗涤3次后，重悬于PBS中，其终浓度为1％。将1％猪红细胞与PBS稀释的1％人血清在血凝板混合上，再分别加入不同浓度的阳性噬菌体和多肽溶液混匀，室温静置1小时后观察结果。如果红细胞沉淀到孔底，呈一边缘光滑的圆点，则为没有凝集；如果红细胞形成网络结构，没有下沉到孔底，则为凝集。凝血实验表明8个克隆展示的多肽可有效抑制由人天然抗α-Gal抗体诱发的凝血反应。 为了寻找应用于异种器官移植中的多肽药物，我们从两个肽库中筛选出了9条多肽，经ELISA检验它们都特异性地结合于α-Gal抗原结合位点，凝血实验表明8个克隆展示的多肽可有效抑制由人天然抗α-Gal抗体诱发的凝血反应。因此这些多肽在空间构象上能够模拟α-Gal抗原表位的分子结构，都是α-Gal抗原表位的模拟肽。

目录

前言

实验材料与试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

噬菌体展示技术的原理及研究进展

参加的课题与发表的论文

致谢