抗人间充质干细胞（MSCs）单克隆抗体的制备及其生物学特性研究

摘要

人骨髓间充质干细胞(humanMesenchymalStemCells，hMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞群体，是近年来干细胞研究领域的一个热点。hMSCs是组织工程和再生医学的理想种子细胞，在临床具有广阔的应用前景。 近十年来干细胞生物学研究领域的突破，使人们对hMSCs的生物学特性有了较深入的认识，但迄今为止尚未发现其特异表面膜标志，现行的分离方法主要是根据hMSCs的生长特性、表型特征和所具有的多向分化潜能进行评判，影响因素多，操作繁琐，费用昂贵，所得细胞均一性尚不理想，且不同实验室之间数据的可比性差。因而人们一直在努力寻找特异的hMSCs的标记分子。 本研究以分离培养的hMSCs免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术制备抗hMSCs的单克隆抗体，并通过间接免疫荧光、免疫组织化学及流式细胞术等方法对其生物学特性作了初步的鉴定，并以制备的单克隆抗体作探针，用于hMSCs的分选及表面特异性膜分子研究。 实验方法 1.hMSCs的分离培养与鉴定：从正常健康供者获取骨髓，以Ficoll-paque分离液分离获取单个核细胞层经培养后，弃去非贴壁细胞，以10％胎牛血清的LG-DMEM培养液传代培养，所得细胞用流式细胞仪检测其表型。 2.抗hMSCs单克隆抗体的制备：采用多供体(2份以上供者)hMSCs以0.01MpH7.2PBS悬浮免疫BALB/C小鼠，每只0.2ml(1.0×106)腹腔注射，每周1次，共4次，于融合前3天加强免疫一次。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0在50％PEG(MW4000)作用下融合，用含20％小牛血清的HAT选择性培养基培养。以改良的间接免疫荧光法筛选抗体。选择阳性克隆进行有限稀释克隆化培养，直至抗体阳性率达100％，杂交瘤细胞接种于经液体石蜡处理过的BALB/C小鼠腹腔，两周左右后收集腹水，以间接免疫荧光测腹水效价，又以免疫金层析法测定单克隆抗体的类别.用盐析法和DEAE纤维素离子交换纯化，SDS-PAGE鉴定纯度。 3.抗hMCSs单抗的生物学特性检测：采用间接ELISA测定5株单抗的亲和力，并进行表位结合分析，用间接免疫荧光法检测了外周血淋巴细胞、HL-60、Raji、血管内皮细胞及大鼠间充质干细胞与单抗的交叉反应；又以免疫组织化学法检测了5株单抗在肌肉、骨髓神经等12种组织标本中的表达。 4.应用：(1)建立免疫磁珠分选hMCSs通过正向免疫磁珠分选骨髓单个核细胞，继而用流式细胞术检测其纯度及表型特征，并对筛选后的细胞作分化能力进行研究。(2)单抗的荧光标记用FITC直标纯化后的单抗，用于hMCSs的鉴定。 结果 1.hMSCs的分离培养与鉴定：分离所得hMSCs经传代培养，弃去非贴壁细胞后，得较纯hMSCs，以流式细胞仪检测其表型为CD29+、CD44+、CD166+、CD34-、CD45-、HLA-DR-。 2.抗hMSCs单克隆抗体的制备：以分离培养的hMSCs免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。在融合的1248孔中，经间接免疫荧光法筛选到阳性杂交瘤27孔，上述阳性孔细胞作适当扩大培养后，液氮保存。在27个阳性杂交瘤孔中取10孔进行有限稀释克隆化培养，结果获得能稳定分泌抗hMSCs单克隆抗体杂交瘤细胞5株，定名为ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUE12和ZUF10。上述细胞株经3次以上克隆化培养，在体外持续培养6月余，分泌抗体性能稳定，冻存、复苏后细胞生长良好。5株单抗效价(腹水)均＞106，单抗的类别除ZUC3为IgMκ外，其余4株均为IgG1κ。 3.特性检测：5株单抗的相对亲和力分别为：ZUB1：1×106、ZUB4：1×105、ZUC3：1×106、ZUE12：1×105、ZUF10：1×105。表位分析的结果提示ZUB1、ZUE12、ZUF10针对相同的表位，ZUC3及ZUB4则分别针对不同的表位，用间接免疫荧光法将5株单克隆抗体分别与外周血淋巴细胞、HL-60、Raji、血管内皮细胞及大鼠MSCs作交叉反应，同时以免疫组织化学法检测了12个间充质和非间充质来源的组织标本，以hMSCs作阳性对照，结果5个单克隆抗体除ZUC3对大鼠来源的MSCs有反应外，其余均未见交叉反应 4.应用：通过建立的正向免疫磁珠分选法对骨髓单个核细胞进行分选，7-10×107人骨髓单个核细胞可获得4-5×105细胞，此群细胞CD29、CD44、CD105、CD166阳性，造血细胞分化抗原则为阴性，并具有向多种细胞分化的潜能。 结论 本研究制备了5株特异性针对hMSCs表面膜分子的单克隆抗体，为寻找间充质干细胞特异膜表面分子提供了有效工具，同时也为进一步阐明间充质干细胞的生物学功能及临床应用奠定了基础。

目录

前 言

材料与方法

结果

讨 论

结论

参考文献

综 述 骨髓间充质干细胞研究进展

参加课题与发表论文

致谢