氧化应激和阿霉素诱导人类精子H2AX磷酸化及生物学意义

摘要

生殖毒性物质包括多种物理以及化学因素，能够引起人类生殖细胞DNA损伤。由于精子DNA损伤可能影响到正常受精和早期胚胎发育，甚至还有可能导致胎儿发育畸形以及子代先天遗传疾病的发生。因此，了解精子细胞针对DNA损伤发生的应激反应，寻找敏感、特异的检测精子DNA损伤方法将会有助于人们早期识别遗传损伤因素、及时预防治疗精子DNA损伤，从而减少男性不育以及妊娠不良结局的发生。 氧化应激(Oxidativestress)是引起精子DNA损伤的常见因素之一。在生理状态下，活性氧类物质(Reactiveoxygenspecies，ROS)具有调节成熟精子正常生理功能的作用；相反，ROS产生增加就会引起细胞内氧化应激状态。在氧化应激状态下，精子细胞发生一系列病理改变，其中包括DNA损伤一而且此种情况常见于男性不育患者。然而，目前人们还不清楚DNA氧化损伤后精子细胞会发生什么样的应激反应；另外，目前还缺少能够用于临床上检测精子DNA氧化损伤的可靠方法。 阿霉素是一种常用于肿瘤治疗的化疗药物，它属于另外一类的遗传毒性化合物。研究发现，阿霉素主要通过引起细胞DNA损伤，进而导致男性生殖功能异常。在发育成熟过程中，处于不同生长、分化阶段的雄性生殖细胞对于化疗损伤的易感性不同，因此阿霉素引起精子DNA损伤的程度、类型主要取决于遗传毒物暴露时生殖细胞所处的生长发育成熟阶段；而且由于晚期成熟阶段精子DNA损伤修复能力较弱，因此对于化疗药物引起的损伤更加敏感。迄今为止，几乎所有关于阿霉素引起精子DNA损伤的研究都集中在细胞发育成熟的早期阶段，而这种类型的细胞处在生长分裂旺盛时期；相反，对于减数分裂后期的生殖细胞一尤其是晚期成熟的精子细胞一DNA损伤的了解较少，而这些细胞处于分化终末期、基因转录暂时停止，同时也不再发生细胞分裂。 最近，~H2AX(磷酸化的组蛋白H2AX)被认为是细胞DNA损伤，尤其是细胞DNA双链断裂，敏感而且特异的标志物。研究发现，电离辐射以及其它引起遗传损伤因素暴露均能够迅速激活P13K家族激酶，进而诱导细胞H2AX发生磷酸化形成~H2AX，随后~H2AX在DNA损伤部位形成焦点。我们最近研究同样发现，多种类型的物理化学因素均能够诱导~H2AX焦点形成，而．I~．~H2AX焦点可以被用来评价细胞DNA损伤程度。此外，~H2AX焦点还能吸引其它细胞检查点、DNA损伤修复蛋白Mretl／Rad50／Nbsl(MRN)，BRCAl，53BPl等形成复合体，介导细胞针对DSBs的应激反应，具有DNA损伤修复、细胞周期检查点调控以及细胞凋亡启动等功能。因此，上述相关蛋白的检测有助于人们了解DNA损伤后细胞发生的应激反应，以及判断DNA损伤细胞最终的命运。 本研究分别利用不同剂量强度的H202和阿霉素在体外处理正常男性成熟精子细胞，然后观察不同时间点精子细胞内DNA损伤感受和修复蛋白~H2AX／53BPl／Rad50的动态变化，旨在从分子水平探讨~H2AX作为人类精子DNA损伤指标可行性以及了解精子针对DAN损伤发生的应激反应。另外，本研究还选择人体细胞FL作为精子的实验对照，并进行同期处理观察。 结果发现 LH202和阿霉素诱导精子DSBs产生 我们利用中性彗星实验(Cometassay)，一种经典的在单细胞水平上检测DNA损伤的方法，检测DNA双链断裂(DSBs)，并以尾矩(Tailmoment，TM)表示DNA损伤程度。结果发现，H202和阿霉素均能诱导精子DNA发生双链断裂(DSBs)，并且在一定范围内呈时间一剂量依赖效应。尽管H2O2暴露短时间内(0.5mM，30min)以及低浓度H2O2(O．1mM，8h)条件下并不能促使TM明显增加，而随着浓度增加或者作用时间延长TM增加均十分显著。相反，研究发现阿霉素在各个剂量组(O．4，2，10~g／m1)以及时间点(O.5，2，8，24h)均能使精子TM增加。 2.H202和阿霉素诱导精子H2AX磷酸化 免疫荧光镜下观察发现，H202和阿霉素均能诱导精子H2AX磷酸化，而且流式细胞分析结果进一步证实H2AX磷酸化水平与H202和阿霉素剂量强度、作用时间成正相关。但是，~H2AX在精子细胞核内分布呈现均一的阳性染色，这与人FL体细胞核内~H2AX焦点表现明显不同的分布特征。上述结果提示，遗传毒物H202和阿霉素能够诱导精子细胞核内H2AX发生磷酸，而且其磷酸化水平呈现剂量一时间依赖效应；精子细胞内~H2AX分布特征与体细胞明显不同，其分布差异可能反应了生殖细胞特殊的生物学功能特征。 3.Wortmannin抑制人精子细胞内H2AX发生磷酸化 研究发现PI-3K家族激酶抑制物wortmannin能够抑制IR和复制压力所诱导的H2AX的磷酸化。因此，我们进一步观察了wortmannin对于氧化应激损伤以及阿霉素诱导产生~H2AX的影响。为减少wortmannin降解，精子在H202或者阿霉素处理前用wortmannin孵育30分钟，并在处理后2h给予第二个剂量，8h后收集精子进行H2AX标记，用于免疫荧光镜下检测或者流式细胞分析。免疫荧光镜下观察发现wortmannin处理完全抑制H202或者阿霉素诱导的H2AX的磷酸化，流式细胞分析结果同样显示，wortmannin促使处理后H202精子细胞~H2AX平均荧光强度以及~H2AX阳性细胞百分率均明显降低，接近药物处理前水平。因此，H202和阿霉素所诱导的H2AX磷酸化依赖于PI-3K家族激酶。4.H202和阿霉素诱导精子γH2AX、RadS0和53BPl共定位 研究发现，体细胞DNA损伤诱导H2AX磷酸化形成~H2AX，随后募集其它DNA损伤修复蛋白因子如53BPl以及Rad50，在DNA损伤位点形成复合体，参与DNA损伤修复以及凋亡启动等细胞应激反应。因此，本实验进一步观察H202或者阿霉素诱导人类精子DNA损伤过程中~H2AX、Rad50和53BPl变化以及相互关系。结果发现，伴随精子DNA损伤过程中H2AX磷酸化，Rad50和53BPl同时出现在精子细胞核内，但是其分布呈现均一的阳性染色：相反，相同条件下，人FL细胞则表现Rad50和53BPl焦点形成，而且焦点与γH2AX呈现明显的共定位现象。 5．去除损伤因素后精子~／I-12AX变化以及DNA损伤修复 ~H2AX修复系统在体细胞DNA损伤修复过程中具有重要作用，~H2AX焦点消失提示DNA损伤修复已经完成，因而被认为是反应DNA修复能力的客观指标。由于通常认为人类成熟精子已经暂时失去DNA损伤修复能力，那么推测去除损害因素后，~H2AX应该持续存在。为了验证上述假设，精子细胞处理两小时后去除H202，镜下观察发现~H2AX持续存在，而且流式细胞分析结果也证实~H2AX免疫荧光强度以及阳性细胞百分比均无明显变化。然而，体细胞FL实验发现，去除损害因素H202后，~H2AX迅速消失，至4h已经完全恢复到处理前的水平。上述结果提示，人类成熟精子暂时失去DNA损伤修复能力，而~H2AX、Rad50以及53BP!出现并不具备修复DNA损伤功能或者其修复功能缺陷。 根据上述结果，可以得出以下结论： 1.H2O2和阿霉素均能够诱导精子H2AX发生磷酸化，而且呈现剂量一时间依赖效应：精子H2AX磷酸化依赖P13K激酶途径。 2.H202和者阿霉素诱导的H2AX磷酸化是针对精子DNA损伤的特异应激反应，由此推测~H2AX可能成为检测精子DNA损伤的特异指标。 3.精子细胞内~H2AX／Rad50／53BPl等蛋白复合物的DNA损伤修复功能缺失，而很有可能参与DNA损伤诱导的精子细胞凋亡的启动调节。

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