纺锤体检查点及细胞周期相关基因在卵巢癌细胞对紫杉醇获得性耐药中的作用

摘要

研究背景 卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤,总的5年生存率为44﹪,其中晚期病例不足30﹪.自从90年代紫杉醇成为最主要的一线化疗药物以来,晚期卵巢癌的近期缓解率已达到80﹪以上,但大多数患者在2～3年内复发,几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药,化疗耐药已成为卵巢癌患者治疗失败和死亡的主要原因. 紫杉醇主要通过与细胞B微管蛋白结合,促进微管聚合,使其稳定,使细胞阻滞于G<,2>/M期,进而以P53依赖性和非依赖性途径介导细胞凋亡.目前认为肿瘤细胞对紫杉醇耐药的可能机制主要包括:P糖蛋白(P-gp)等膜转运分子表达上调导致细胞内药物浓度降低;B微管蛋白表达改变;抗凋亡蛋白Bc1-2表达上调等凋亡信号途径调控异常.尽管体外研究阐明的耐药机制越来越多,但一系列针对这些可能机制而设计的临床试验的效果非常有限,提示与传统的耐药机制不同的其他分子机制可能在肿瘤细胞获得紫杉醇耐药性的过程中发挥更重要作用. 关于纺锤体检查点与抗微管类化疗药物敏感性之间的关系是近年肿瘤化疗耐药研究的一个前沿课题,但在仅有的几个研究中结果尚存在矛盾.如Sudo发现,向乳腺癌MCF-7细胞系短暂转染Mad2或BubRl短片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可使细胞纺锤体检查点功能缺失,进而抑制紫杉醇诱导的细胞死亡.但组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)通过抑制细胞的纺锤体检查点功能却增强包括紫杉醇在内的抗微管药物的杀瘤效应.Tao等也发现,能维持长时间纺锤体检查点信号(即纺锤体检查点功能较好)的结肠癌细胞HT29更不易被紫杉醇和驱动蛋白纺锤体蛋白(kiIaesin spindle protein,KSP)抑制剂杀伤.因此,肿瘤细胞的纺锤体检查点功能与抗有丝分裂药物敏感性的关系需要进一步探索. 本研究首先以人卵巢癌细胞系SKOV3为亲本细胞,用中等剂量间歇作用结合低剂量持续作用法诱导建立耐紫杉醇细胞模型,并观察P-gp表达和β微管蛋白亚型改变在卵巢癌细胞获得紫杉醇耐药性过程中的作用;在此基础上,着重研究耐紫杉醇细胞亚系的纺锤体检查点功能状态及其主要组分Mad2和BubR1蛋白的表达水平;最后利用功能基因芯片技术比较耐紫杉醇细胞亚系及其亲本细胞系的细胞周期调控基因表达差异,以寻找新的耐药相关基因.旨在阐明卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药的分子机制,为克服肿瘤耐药提供新的理论依据. 第一部分耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的建立及特征 研究目的 建立稳定、可靠的耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系,为紫杉醇耐药机制的研究提供实验模型;并探讨P-gp和β微管蛋白亚型在卵巢癌细胞获得紫杉醇耐药性过程中的作用. 结论 1.成功建立了耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30,为研究卵巢癌发生紫杉醇获得性耐药的机制、寻找逆转耐药的新方法提供了可靠的体外实验模型. 2.P-gp在SKOV3-TR30获得紫杉醇耐药性过程中不起重要作用,但β微管蛋白亚型表达改变可能与卵巢癌紫杉醇获得性耐药有关. 第二部分SKOV3-TR30细胞纺锤体检查点功能及Mad2、BubR1蛋白表达 研究目的 检测耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的纺锤体检查点功能状态及其主要组分Mad2和BubR1蛋白的表达水平,以探讨卵巢癌细胞的纺锤体检查点功能与紫杉醇获得性耐药的关系. 结论 耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的纺锤体检查点功能存在部分缺失或减弱,由BubR1蛋白表达下调所致的纺锤体检查点功能减弱可能是卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药的机制之一. 第三部分细胞周期相关基因在SKOV3一TR30细胞中的表达变化 研究目的 比较耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30与其亲本细胞系SKOV3的细胞周期相关基因表达谱的差异,以寻找卵巢癌新的耐药相关基因. 结论：耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系有多个细胞周期相关基因表达异常，其中GSK－3表达上调可能是卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药的新机制。

目录

缩略词表

前言

第一部分 耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的建立及特征

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 SKOV3-TR30细胞纺锤体检查点功能及Mad2、BubR1蛋白表达

第三部分 细胞周期相关基因在SKOV3-TR30细胞中的表达

结论

综述一 卵巢癌细胞耐药机制及其对策研究进展

综述二 肿瘤与纺锤体检查点的研究现状

附录

致谢