iNOS mRNA在慢性鼻窦炎鼻内镜术后组织中的表达及意义

摘要

慢性鼻窦炎是一种很常见的鼻部疾病.其病因目前认为是鼻部微环境的炎症反应,其发病多认为是多因素多步骤共同作用的结果.慢性鼻窦炎治愈标准应是粘膜炎症的彻底消除.虽然目前功能性鼻内镜鼻窦手术对治疗慢性鼻窦炎的有效性已被临床实践所证明,但是鼻内镜手术后鼻粘膜上皮的创伤修复是一个复杂的过程.如何减轻术后鼻粘膜炎症的持续状态,加快粘膜上皮的创伤修复是现今鼻内镜外科急需解决的棘手问题.NO属于神经递质等富反应性的极小气体分子,在炎症和免疫反应中发挥着重要作用.NO是在一氧化氮合酶(NOS)作用下合成的.NOS分3型:神经元型NOS(nNOS)、诱发型NOs(iNOS)和内皮型NOS(eNOS).nNOS和eNOS统称为结构型,主要调节生理功能.INOS主要在病理情况下产生,在疾病的发病和病理过程中起重要作用.iNOS在多种细胞内表达,受炎症因子刺激后活化产生大量一氧化氮,NO通过其细胞毒性作用损伤细胞,增加微血管通透性,抑制血小板聚集及粘附等作用,从而促进组织水肿形成. 本文应用原位杂交技术,测定iNOS mRNA在慢性鼻窦炎鼻内镜术后组织中的分布和表达水平,探讨NO和iNOS在慢性鼻窦炎手术后鼻粘膜上皮的创伤修复过程中的作用和临床意义. 一.材料和方法 1.实验材料收集2006年在浙江大学附属第一医院接受鼻内镜手术并进行复诊的慢性鼻窦炎(Ⅱ型)患者,共30例,其中Ⅱ型1期3例Ⅱ型,2期15例, Ⅱ型3期12例.根据复诊时间,分为三组,分别为术后一月组、术后三月组、术后六月组.各例患者在鼻内镜复诊时取钩突切除后的切缘中部的组织,直径约0.5cm.及时石蜡包埋,分批进行原位杂交.另选8例Ⅱ型慢性鼻窦炎患者的息肉组织和5例健康人的鼻粘膜作为对照组. 2.实验方法(1)取手术切除的新鲜标本,用4﹪多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)(含1/1000的DEPC)固定一小时. (2)常规脱水、浸蜡、包埋.切片,厚度8μm. (3)石蜡切片经常规脱蜡至水.30﹪H<,2>O<,2> 1份+蒸馏水10份混合,室温10分钟以灭活内源性酶.蒸馏水洗3次,每次5分钟. (4)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3﹪柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3﹪柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃恒温水浴箱内消化30分钟.原位杂交用PBS洗3次×5分钟.蒸馏水洗1次×5分钟. (5)后固定:固定液为1﹪多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC.室温固定10分钟.蒸馏水洗涤3次×5分钟 (6)预杂交:按每张切片20μι加预杂交液.恒温水浴箱42℃4小时.吸取多余液体,不洗. (7)杂交:按每张切片20 μι杂交液,加在切片上.将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上.恒温箱42℃杂交过夜. (8)杂交后洗涤:揭掉盖玻片,原位杂交用PBS洗3次×15分钟. (9)滴加封闭液:37℃恒温水浴箱30分钟.甩去多余液体,不洗. (10)滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃恒温水浴箱90分钟.原位杂交用PBS洗5分钟×4次.C (11)滴加SABC:37℃恒温水浴箱30分钟.原位杂交用PBS洗5分钟×3次. (12)滴加生物素化过氧化物酶:37℃恒温水浴箱20分钟.原位杂交用PBS洗5分钟×4次. (13)DAB显色:显色15分钟,充分水洗5分钟. (14)苏木素复染30秒,充分水洗15分钟. (15)干燥后,中性树胶封片,镜检. 二.结果 显微镜下见原位杂交阳性的细胞胞浆着色呈棕黄色,而阴性细胞的胞浆则呈普通的淡蓝色.正常鼻黏膜组可见iNOS mRNA阳性细胞主要分布在黏膜下,数量极少.Ⅱ型慢性鼻窦炎息肉组可见阳性细胞在黏膜下腺体周围及血管周围均有大量分布.Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组及三月组中可见阳性细胞在黏膜下腺体及血管周围有分布,Ⅱ型慢性鼻窦炎术后六月组可见iNOS mRNA阳性细胞主要分布在黏膜下,数量极少. 在400倍光镜下,观察并计数切片中阳性表达的细胞.iNOS mRNA阳性细胞在正常鼻黏膜和慢性鼻窦炎鼻息肉组织及慢性鼻窦炎鼻内镜手术后组织中都有阳性表达.在正常鼻黏膜组织中,iNOS mRNA的阳性细胞率为(1.18±0.24)﹪;在Ⅱ型慢性鼻窦炎的组织中,iNOs mRNA的阳性细胞率为(18.43±4.31)﹪;在Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组织中,iNOS mRNA的阳性细胞率为(15.40±1.64)﹪; 在Ⅱ型慢性鼻窦炎术后三月组织中,iNoS mRNA的阳性细胞率为(8.34±0.78)﹪;在Ⅱ型慢性鼻窦炎术后六月组织中,iNOS mRNA的阳性细胞率为(1.31±0.27)﹪.Ⅱ型慢性鼻窦炎息肉组iNOS mRNA阳性细胞率较正常的鼻黏膜组明显升高,t检验,p<0.05,差异有显著性意义.Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组iNOS mRNA阳性细胞率较II型慢性鼻窦炎组无明显降低,p>0.05,差异无显著性意义.Ⅱ型慢性鼻窦炎术后三月组iNOS mRNA阳性细胞率较II型慢性鼻窦炎组明显降低,t检验,p<0.05,差异有显著性意义:较Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组明显降低,t检验,p<0.05,差异有显著性意义;较正常的鼻黏膜组明显升高,t检验,p<0.05,差异有显著性意义.Ⅱ型慢性鼻窦炎术后六月组iNOS mRNA阳性细胞率较Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组明显降低,t检验,p<0.05,差异有显著性意义;较Ⅱ型慢性鼻窦炎术后三月组明显降低,t检验,p<0.05,差异有显著性意义;较正常鼻黏膜组无明显升高,t检验,p>0.05,差异无显著性意义. 三.结论 1)在正常鼻粘膜中可有iNOS mRNA阳性低表达,说明iNOS这种低表达是维持正常鼻腔生理功能所必需的. 2)本检测中Ⅱ型慢性鼻窦炎息肉组织以及术后一月组织、三月组织中中iNOS mRNA阳性细胞率较正常的鼻黏膜组织明显升高,并且有统计学意义,这说明了iNOS和NO在慢性鼻窦炎以及术后粘膜炎症持续状态的发病机制中起到一定的作用. 3)本检测中Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组织、三月组织、六月组织之间iNOSmRNA阳性细胞率有显著差异,并随术后时间推延表达逐渐减少.说明NOS表达的增加和随后引起的NO释放可能在慢性鼻窦炎以及术后粘膜炎症持续状态的发病机制中起到一定的作用.Ⅱ型慢性鼻窦炎术后一月组织中iNOS mRNA阳性细胞率较Ⅱ型慢性鼻窦炎息肉组织无明显降低,说明术后一月是FESS术后黏膜炎症持续时期,也是黏膜上皮化的关键时期.术后三月组织中iNOSmRNA阳性细胞率较Ⅱ型慢性鼻窦炎息肉组织明显降低,但仍较正常的鼻黏膜组织明显升高.术后六月组织中iNOS mRNA阳性细胞率与正常鼻黏膜组织无明显差异,说明术后鼻粘膜的上皮再生是一个较为漫长的过程,FESS术后随访至少应大于6月.

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附件及插图

综述：一氧化氮与鼻息肉

致谢