SAM高产酿酒酵母菌株的诱变选育和高密度发酵培养以及SAM的分离纯化

摘要

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,简称SAM,SAMe或AdoMet),是存在于所有生物体内的重要代谢中间物质,作为甲基供体参与体内许多关键的生化反应.SAM对肝病、抑郁症、关节炎等疾病均有显著疗效,在医药行业和保健品领域得到广泛的应用.目前国内对SAM的研究尚处于实验室水平,早日实现SAM的工业化生产具有重大的社会意义和经济效益.本文主要研究了SAM高产酿酒酵母菌株的诱变选育和高密度发酵培养以及SAM的分离纯化. 酿酒酵母(S.cerevisiae)胞内积累SAM的能力要比其它的微生物高出许多,是目前工业化发酵生产SAM的主要菌株.本文通过对十种酵母菌株胞内积累SAM能力的考察,筛选到一支SAM高产菌株ZJUSC007,其SAM单位产量为297.82mg·L<'-1>,胞内含量为37.76mg·gDCW<'-1>. 酿酒酵母细胞中,通过甲基化反应合成麦角固醇是SAM的主要消耗途径之一.以ZJUSC007为出发菌株,通过紫外线诱变的方法,以制霉菌素抗性为筛选标记,获得了具有麦角固醇合成缺陷的突变菌株.确定紫外线照射时间为20s,制霉菌素浓度为15mg·L<'-1>.总共对364个突变株进行了复筛,最终得到一支SAM高产突变菌株ZJUISCM186,其单位产量为450.07mg·L<'-1>,胞内含量为62.73mg·gDCW<'-1>,比出发菌株分别提高了42.24﹪和57.02﹪.通过单因素实验对突变菌株的培养条件进行优化.结果表明:初始葡萄糖30g·L<'-1>,酵母提取物5g·L<'-1>,(NH4)<,2>SO<,4> 5g·L<'-1>,K<'+>0.15M,补加L-甲硫氨酸1g·L<'-1>,转化时间30h,最终SAM单位产量达到582.59mg·L<'-1>胞内含量达到71.52mg·gDCW<'-1>. 考察了三种不同的酿酒酵母细胞在高密度发酵培养过程中生产SAM的能力.结果表明:突变菌株ZJUSCM186的SAM单位产量和胞内含量以及菌体密度都很低,分别只有0.43g·L<'-1>,6.6mg·gDCW<'-1>和55,不适合用来高密度发酵培养生产SAM.酿酒酵母SC021的菌体密度高达300,SAM产量接近3.0g·L<'-1>,胞内含量达到43mg·gDCW<'-1>,基本实现了高密度发酵培养生产SAM的目标.基因工程菌ZJUSCG054是以酿酒酵母SC021为宿主菌,其高密度发酵培养过程与SC021十分相似,SAM产量和胞内含量均略高于SC021. 采用HD-2树脂对SAM进行分离纯化.确定最佳吸附条件:流速2.0BV·h<'-1>,料液浓度10.11g·L<'-1>,pH5.0;最佳洗脱条件:硫酸浓度0.1mol·L<'-1>,洗脱流速2.0BV·h<'-1>.洗脱液中SAM的HPLC纯度达到98.16﹪;洗脱效率91.78﹪,回收率71.29﹪.

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1概述

1.2 SAM基本性质和临床应用

1.2.1 SAM的理化性质

1.2.2 SAM体内代谢途径

1.2.3 SAM的降解途径

1.2.4 SAM的临床应用

1.3微生物诱变育种

1.3.1诱变剂的选择

1.3.2诱变方式的选择

1.4微生物的高密度发酵培养

1.4.1流加物质的种类

1.4.2流加策略及其控制

1.5 SAM的分离纯化及其稳定性盐的制备

1.5.1 SAM的分离纯化

1.5.2 SAM的稳定性盐

1.5.3 SAM稳定性盐的制备过程

1.6研究思路和内容

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

2.1.2实验药品

2.1.3离子交换树脂

2.1.4菌种及保藏

2.1.5培养基

2.1.6流加物质

2.2实验方法

2.2.1培养及转化条件

2.2.2诱变育种

2.2.3 SAM分离纯化

2.3分析方法

2.3.1细胞干重测定

2.3.2细胞密度测定

2.3.3 SAM定量分析

2.3.4葡萄糖浓度测定

2.3.5其它

第三章SAM产生菌的自然筛选

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与讨论

3.3.1十种酵母细胞积累SAM能力的考察

3.3.2不同萃取剂对SAM破胞萃取效果的影响

3.3.3萃取次数对检测结果的影响

3.3.4酿酒酵母ZJUSC007种子培养生长曲线的绘制

3.3.5 L-甲硫氨酸加入形式对SAM产量和细胞干重的影响

3.4本章小结

第四章SAM高产酿酒酵母菌株的诱变选育和培养条件优化

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌种

4.2.2其它

4.3结果与讨论

4.3.1菌悬液稀释度的确定

4.3.2紫外线照射时间的确定

4.3.3制霉菌素浓度的确定

4.3.4制霉菌素浓度与突变频率的关系

4.3.5高产菌株的筛选

4.3.6 SAM高产酿酒酵母菌株的培养条件优化

4.4本章小结

第五章酿酒酵母细胞的高密度发酵培养

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1菌种

5.2.2其它

5.3结果与讨论

5.3.1三种不同的酿酒酵母细胞高密度发酵培养结果比较

5.3.2前体L-甲硫氨酸加入时间对高密度发酵培养结果的影响

5.4本章小结

第六章SAM的分离纯化

6.1引言

6.2材料与方法

6.3结果与讨论

6.3.1弱酸性阳离子交换树脂JK110和HD-2性能比较

6.3.2离子交换动力学

6.3.3速率控制步骤的判断

6.3.4 SAM在HD-2树脂上的动态离子交换过程

6.3.5洗脱条件的确定

6.3.6用弱酸性阳离子交换树脂HD-2分离纯化SAM的工艺流程

6.4本章小结

本章参数符号说明

第七章总结与展望

参考文献

致谢