缺血后处理减轻大鼠全脑缺血-再灌注损伤的作用及其机制研究

摘要

最近卫生部公布我国城市和农村地区脑血管病均已经成为继恶性肿瘤后的第二大死亡原因,随着我国步入老龄化社会,脑血管病的发病率呈逐年增高的趋势.其居高不下的致死率及致残率给患者及亲属带来极大的心理压力,给家庭和社会造成严重的经济负担,已成为现代医学中急需攻克的难题. 快速恢复血液灌流是减小梗死面积和促进功能恢复最有效的方法,因为及时恢复血液再灌注可以挽救部分可逆性损伤的神经元,减轻脑缺血损伤.然而缺血后的血流恢复在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍,因为ROS过量产生、钙超载等通常发生在再灌注早期,这种恢复血流灌注后引起的进一步损害称为缺血一再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury). 缺血-再灌注损伤机制十分复杂,相互间构成一个负反馈的级联网络.多年来科学家试图找到有效的药物或干预措施来减轻缺血-再灌注损伤,虽然发现有些药物或处理措施在实验动物身上有效,但到目前为止能成功应用于临床的仍然很少.缺血后处理,即在缺血后给予几个短暂的灌注/再缺血循环的处理措施,首先在心脏的缺血一再灌注损伤中被证明有保护作用.因缺血后处理能在缺血后实施,且是通过激发机体内在的保护机制,其潜在的临床应用前景引起了科研工作者的兴趣. 最近研究表明缺血后处理也能对抗神经组织的缺血-再灌注损伤:减小大鼠脑梗死的面积,改善兔脊髓缺血损伤后运动功能.脑组织对缺血缺氧尤为敏感,相当多的临床事件均会导致全脑缺血缺氧,因此在这些事件中大脑也是最容易损伤的部位,其中海马和皮层神经元损伤尤重.然而缺血后处理是否能够对抗全脑缺血-再灌注损伤尚未见报道,阐明这一问题将可能给临床带来除药物外另一有希望的治疗选择. 因此,本研究旨在探讨缺血后处理在全脑缺血再灌注损伤中可能的保护作用及其相关机制. 研究内容: 1、缺血再灌注7天后取脑,行HE染色,计数海马CA1区每mill,皮层每mm<'2>存活细胞数,观察缺血后处理能否减少全脑缺血再灌注损伤后神经元的死亡. 2、缺血再灌注7天后用Moms水迷宫评价其学习记忆能力,观察缺血再灌注损伤后大鼠学习记忆能力的减退程度,以及缺血后处理能否改善缺血后大鼠的学习记忆能力. 3、用激光多普勒血流监测仪对比观察每组大鼠缺血前、缺血中、缺血后处理中及完全再灌注后脑血流灌注的变化情况. 4、缺血再灌注6h,12h取脑行细胞色素C免疫组化染色,观察缺血后处理对缺血再灌注后细胞色素C从线粒体释放到细胞质的影响. 方法: 1、全脑缺血模型制作:应用四血管结扎法(4-VO)制作全脑缺血模型,第一天双侧颈总动脉下埋线备用,并凝闭双侧椎动脉,第二天用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉,缺血10min. 2、缺血后处理方法:缺血后完全复灌之前再夹闭双侧颈总动脉施行三次短暂缺血. 3、实验分组:整个实验动物分为6组:①假手术组(Sham);②模型组(Control);③后处理组Ⅰ(Post-15/15):完全复灌前进行15s/15s再灌注/缺血三个循环;④后处理组Ⅱ(Post-30/30):完全复灌前进行30s/30s再灌注/缺血三个循环;⑤后处理组Ⅲ(Post-60/15):完全复灌前进行60s/15s再灌注/缺血三个循环;⑥后处理组Ⅳ(Post-45-15/15):复灌Us后再进行15s/15s再灌注/缺血三个循环. 4、HE染色:经左心室灌注固定、取脑石蜡包埋、制作海马冠状切片、常规HE染色,光镜下计数海马CAl区每mm,皮层每mm<'2>存活细胞数量. 5、行为学评价:缺血后一周在Moms水迷宫中训练大鼠的学习记忆能力,记录其游泳轨迹并用软件分析training trail中潜伏期、游泳路程和游泳速度,probe test中大鼠在原平台象限的游泳时间. 6、脑血流灌注量的测定:凝闭椎动脉手术过程中安装探头座,用激光多普勒血流监测仪记录缺血前、缺血中、缺血后处理中及完全再灌注后脑血流灌注量. 7、免疫组化染色:经左心室灌注固定、取脑石蜡包埋、制作海马冠状切片、切片脱腊,热修复抗原,行细胞色素C免疫组化染色,光镜下计数海马CA1区每mm,皮层每min<'2>细胞色素C免疫阳性细胞数量. 结果: 1、缺血后处理对全脑缺血-再灌注损伤后神经元死亡的影响缺血后立即给予15s/15s、30s/30s或再灌注45s后再给予15s/15s再灌,缺血三个循环的处理(Post-15/15,Post-30/30,P0st-45-15/15)均能显著增加再灌注7天或3周后大鼠海马和皮层存活神经元数量,而60s/15s再灌,缺血三个循环(Post-60/15)的处理没有观察到保护作用. 2、缺血后处理对全脑缺血-再灌注损伤后大鼠学习记忆能力的影响模型组和Post-60/15组大鼠与假手术组大鼠相比其学习记忆能力显著降低,后处理组(Post-15/15,P0st-30/30,Post-45-15/15)大鼠相比于模型组大鼠学习记忆能力又有显著提高. 3、缺血后处理对缺血后脑血流灌注量的影响缺血后恢复血液灌流所有大鼠均能观察到一段时间的超灌注期,其后又有一段时间的低灌注期,Post-15/15,Post-30/30,Post-45-15/15等三种后处理方式均能显著减少超灌注期的灌注量并缩短超灌注期的持续时间,增加低灌注期的灌注量. 4、缺血后处理对细胞色素C释放的影响缺血10min再灌注6h或12h后海马CAl区和顶皮层细胞色素C免疫阳性神经元显著增加,Post-15/15,Post-30/30处理方式均能显著抑制细胞色素C从线粒体释放到细胞质,而Post-60/15组细胞色素C免疫阳性神经元与模型组相比无显著差异. 结论: 1、全脑缺血-再灌注早期采取及时、适当的后处理干预措施能显著减少大鼠全脑缺血-再灌注损伤神经元的死亡,并改善其学习记忆能力. 2、这一保护作用可能与其改善缺血后脑血流的紊乱、减少细胞色素C从线粒体的释放有关,从而抑制Caspases的激活和神经元的凋亡.

目录

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

Conclusions

References

综 述脑缺血-再灌注损伤机制及治疗措施研究进展

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致 谢