同型半胱氨酸对外周血内皮祖细胞的影响及其机制探讨

摘要

冠心病严重危害人类健康,其传统危险因素包括吸烟、高血压、高血脂、高血糖和肥胖等.新近研究证实血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高也是冠心病一个独立危险因素.高Hcy参与冠心病发病的多个环节,机制十分复杂,其中内皮功能障碍是高Hcy导致冠心病的中心环节.内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间动态平衡的破坏,而内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在内皮损伤后的修复中起重要作用.EPC是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞.研究发现,EPC不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程.近来研究表明EPC在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色.Vasa和Hill分别报道冠心病患者循环血中的EPC数量下降了近50﹪,迁移能力受损,并与危险因子的数目成反向线性关系,而且高危者EPC更易老化.引起冠心病患者EPC数量减少的确切机制尚不明确,可能与患者长期暴露于冠心病的危险因素有关.随后的进一步研究显示糖尿病、高血压、高胆固醇、老龄化及吸烟等冠心病危险因素确实对循环EPC数量和活性具有明显抑制作用.基于上述理论,我们提出假设:高Hey不但直接损伤血管内皮,可能同时影响EPC的数量和功能,继而影响内皮修复能力,打破内皮损伤和修复之间的动态平衡,导致内皮功能障碍,促发冠心病发生.国内外尚无有关高Hey对EPC影响的研究报道,我们如能完成这方面的研究,这不但将丰富冠心病的发病理论,同时将为EPC在冠心病防治的临床应用提供理论依据和直接技术保障.为此,我们首先观察了Hey体外干预对外周血EPC数量和功能的影响,然后进一步观察了高Hey血症患者外周血EPC数量和功能的变化,最后探讨了Hey影响EPC的可能机制.以下分三部分对本研究的方法、结果以及结论作一简述. 第一部分 同型半胱氨酸对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响 目的:观察Hey体外干预对外周血EPC数量和功能的影响. 方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养 7d 后,收集贴壁细胞,加入不同浓度 Hey (10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L 和 200μmol/L )干预24h,观察量效关系.此外,200μmol/LHey分别干预不用时间(6h,12h,24h和48h),观察时效关系.多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acIDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPC,倒置荧光显微镜下计数.采用MTT.比色法、改良的Boyden小室、粘附能力测定实验和体外血管生成试剂盒分别观察EPC的增殖能力、迁移能力、粘附能力和体外血管生成能力. 结论:Hey可减少EPC数量并损害EPC功能,且Hcy对EPC的影响呈一定的量效和时效关系. 第二部分 高同型半胱氨酸血症患者循环内皮祖细胞的变化 目的:观察高Hcy血症患者外周血EPC数量和功能的变化. 方法:入选患者60例,均为本院住院患者,其中高Hcy血症患者组30例,对照组为30例非高Hey血症患者,两组研究对象的临床资料基本匹配.采用全自动荧光偏振免疫分析法检测血浆Hcy,流式细胞仪计数循环EPC(即AC133<'+>KDR<'+>细胞).此外,采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板,培养4d后贴壁细胞进行细胞化学分析.激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-aeLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC.采用改良的Boyden小室和粘附能力测定实验观察EPC的迁移和粘附能力. 结论:高Hey血症患者外周血EPC数量减少、功能减退,且EPC的数量和功能与血Hcy水平呈反向线性关系. 第三部分 同型半胱氨酸影响内皮祖细胞机制的探讨 目的:探讨Hcy影响EPC数量和功能的可能机制. 方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养4d后,收集贴壁细胞,加入不同浓度Hey(10μmol/L,30μmol/L,100μmol/L.和200μmol/L)干预,或先予以1μmol/L阿托伐他汀预处理1h,然后再用200μmol/LHey干预.多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL,双染色阳性细胞为正在分化的EPC,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPC.采用SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞,细胞增殖ELISA试剂盒和集落生成能力测定实验检测EPC的增殖能力和集落形成能力,端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)-ELISA定量检测端粒酶活性,TRAP-聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)-银染法定性检测端粒酶活性,Western blot检测EPC Akt Ser<,473>磷酸化水平. 结论:Hey加速EPC衰老,伴随EPC增殖和集落形成能力的损害.Hey加速EPC衰老可能跟EPC端粒酶活性下降以及Akt磷酸化水平的下降有关,确切机制有待于进一步研究明确.此外,阿托伐他汀可以预防Hey对EPC的损害效应.

目录

主要简略词

前言

第一部分同型半胱氨酸对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分高同型半胱氨酸血症患者循环内皮祖细胞的变化

引言

对象和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分同型半胱氨酸影响内皮祖细胞机制的探讨

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

内皮祖细胞研究进展

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致谢