农杆菌介导rd29A启动子驱动AVP1基因转化匍匐翦股颖的研究

摘要

随着我国草坪业的快速发展，草坪草遗传育种工作越来越受到人们关注，生物技术在草坪草品种改良中具有很大的应用潜力。干旱和高盐是限制草坪草生长的主要环境因子，当前我国特别缺乏抗旱耐盐的草坪草品种。利用植物基因工程技术，克隆并转化抗旱耐盐基因，使其在草坪草中表达，可以明显加快耐盐抗旱新品种的选育，具有广阔的应用前景。 拟南芥液泡质子焦磷酸酶Arabidopsis Vacuolar H<'+>-Pyrophosphatase(AVP1)通过调节液泡膜两侧的质子梯度，控制植物生长激素的运输，随之影响依赖生长素的各种发育事件，使植物在高盐和干旱胁迫下产生适应性。拟南芥rd29A(Resoonsiveto Dehydration，rd29A)启动子是胁迫诱导型启动子，能在干旱、低温和高盐条件驱动下游基因表达。本文运用农杆菌介导法将从拟南芥中克隆的AVP1基因转入匍匐翦股颖，在诱导型的rd29A启动子驱动下进行表达，并对获得的转基因匍匐翦股颖进行抗旱耐盐生理测定，获得了抗旱耐盐性增强的草坪草。 主要实验结果如下： 1、建立了草坪草的愈伤组织遗传转化受体系统。以冷季型草坪草匍匐翦股颖和高羊茅的种子作为外植体，愈伤组织诱导率分别为53.0±8.7％和60.7±7.9％，均能诱导产生胚性愈伤组织，胚性愈伤组织生长稳定，继代一个月后生长速率可达206.0±43.7％和159.3±34.4％。而暖季型草坪草狗牙根以种子作为外植体的愈伤组织诱导率仅为14.7±4.0％，且只产生非胚性愈伤组织，该愈伤组织生长速率为78.4±23.2％；以狗牙根的节作为外植体可以诱导出胚性愈伤组织，但数次继代后转为非胚性愈伤组织。 2、通过农杆菌介导法将rd29A启动子驱动AVP1基因的pCambia1302表达载体转入匍匐翦股颖。分别用浓度为50、75、100mg/L潮霉素筛选转化愈伤组织，三种浓度的筛选率为64.1±5.0％、81.5±1.5％和33.3±3.8％。经过一个半月的筛选，50mg/L潮霉素筛选后的转化愈伤的hpt-PCR阳性植株比率仅为0.9％，75mg/L浓度下的分化植株hpt-PCR阳性比率高达96.7％。因此，确定75mg/L为匍匐翦股颖转化愈伤的最佳筛选浓度。 3、转基因匍匐翦股颖植株的PCR鉴定。获得再生匍匐翦股颖植株90株，其中hpt-PCR阳性株87株，阳性比率为96.7％；AVP1-PCR.阳性株13株，阳性比率为14.4％。 4、转基因匍匐翦股颖愈伤组织中AVP1基因表达的RT-PCR检测。结果显示，在正常培养条件下转基因愈伤AVP1基因微量表达，而在干旱(干燥48h)、低温(4℃，24h)或高盐(200mM NaCl)胁迫下AVP1基因的表达均明显增强；未转基因的野生型材料中，无论处理与否均未检测到AVP1基因的表达。该结果表明在非胁迫条件下rd29A启动子的活性很低，而在干旱、低温或高盐处理条件下活性明显增强，从而启动其下游基因AVP1的表达。由此验证了干旱、低温和高盐条件能促进转基因匍匐翦股颖中目的基因AVP1的表达水平。 5、转基因匍匐翦股颖愈伤组织的抗性生理分析。经干燥处理2天和3天后，转基因愈伤组织的恢复生长速率为645％和543％，野生型的为423％和135％，可见转基因匍匐翦股颖比野生型具有更强的耐旱性；在高盐胁迫下，用0-200 mM不同浓度NaCl处理的转基因愈伤，其生长速率均高于相同情况下的野生型愈伤。尤其是在NaCI浓度分别为50mmol/L，200mmol/L时两者的差异较大，分别相差170％和148％。表明转AVP1基因的匍匐翦股颖的高盐耐受性增强。 6、转基因匍匐翦股颖植株的抗性生理分析。经过9天的干旱胁迫后，转基因翦股颖小苗叶片为鲜绿色，而野生型草叶片则明显萎焉变黄。对干旱处理前后小苗相对含水量进行测定，干旱处理前转基因和野生型翦股颖小苗的含水量差异不明显，而干旱胁迫后转基因翦股颖的含水量为82.6％，明显高于野生型的77.5％，说明转基因匍匐翦股颖比野生型耐旱。转基因植株根的生物量测定结果显示，转基因植株根的干重平均为0.17±0.02g，而野生型植株平均只有0.07±0.01g，两者差异明显。此结果表明转基因植株具有发达的根系，有利于植物吸取土壤中的水份和养分，增强对干旱的耐受性。

目录

摘要

第一章文献综述

第一节植物抗逆机制和相关的基因

1.1植物抗旱机制概述

1.2植物耐盐机制概述

1.3植物抗逆机制相关的基因

第二节草坪草遗传转化研究进展

2.1植株再生体系的建立

2.2农杆菌介导法转化草坪草的研究进展

2.3目前转基因过程中存在的问题

第三节本研究的提出和内容

第二章草坪草愈伤组织转化系统的建立

1.前言

2.材料

2.1草坪草品种

2.2植物激素

2.3培养基

3.方法

3.1愈伤组织的诱导

3.2愈伤组织的继代

3.3培养条件

3.4评价指标

4.结果与分析

4.1愈伤组织的形态观察

4.2不同品种成熟种子的愈伤诱导率和愈伤生长速率比较

5.讨论

第三章农杆菌介导的rd29A启动子驱动AVP1基因的匍匐翦股颖遗传转化

1.前言

2.材料

2.1菌株

2.2质粒载体

2.3受体植物材料

2.4培养基和缓冲液

2.5化学试剂和酶类

3.方法

3.1农杆菌质粒的制备

3.2农杆菌介导的草坪草转化

3.3转基因植株的分子生物学检测

4.结果与分析

4.1农杆菌转化子鉴定

4.2潮霉素抗性愈伤组织的筛选

4.3潮霉素抗性植株的再生

4.4转基因植株的PCR鉴定

4.5转基因匍匐翦股颖的RT-PCR检测

4.6转基因匍匐翦股颖的GFP观察

5.讨论

5.1影响农杆菌遗传转化效率的因素

第四章转AVP1基因的匍匐翦股颖的抗性生理分析

1.前言

2.转基因翦股颖抗性生理分析

2.1转基因匍匐翦股颖耐干旱测定

2.2转基因匍匐翦股颖根的生物量测定

2.3转基因匍匐翦股颖愈伤耐盐测定

3.结果与分析

3.1转基因翦股颖愈伤耐干旱测定

3.2转基因匍匐翦股颖植株耐干旱测定

3.3转基因匍匐翦股颖根的生物量测定

3.4转基因匍匐翦股颖愈伤耐盐性测定

4.讨论

4.1 AVP1能促进匍匐翦股颖根系发育，增强耐旱性

4.2 AVP1控制植物生长素的运输，促进植物器官发育

4.3 AVP1增强匍匐翦股颖耐盐性

4.4后期的研究工作

参考文献

附录

致谢