拟南芥Aux/IAA家族基因IAA2的反向遗传学功能研究

摘要

生长素(auxin)是最早发现的一类植物激素，在植物的生长和发育过程中发挥十分重要的作用，主要包括细胞伸长，细胞分裂，向地性和向光性的形成，维管组织的发育，根毛发育，花的形成等等。生长素的作用机制非常复杂的。近年来，生长素调节基因表达的分子机理取得了较大进展。其中Aux/IAA蛋白，作为一类转录抑制因子，已经被证明在生长素信号转导途径中起到极其重要的作用。 Aux/IAA基因发生突变会使生长素反应因子(ARF)的功能产生紊乱，从而引起生长素相关生长和发育的异常。IAA2是拟南芥29个Aux/IAA基因家族成员之一，目前对该基因研究很少，还没有筛选到此基因的突变体。本文利用反向遗传学方法研究IAA2在拟南芥生长和发育中的功能，得到以下主要结果： 1．利用ATP计划(Arabidopsis Tilling Program)提供的TILLING(Target Induced Lesoins in Local Genomics)技术服务共得到关于IAA2基因的10个点突变，用SIFT软件分析发现其中三个位点突变可能对蛋白质造成了毒害，但是，对这三个突变体进行表型观察时没有发现生长和发育的异常，揭示IAA2基因的功能冗余性。 2．为了研究拟南芥生长和发育中IAA2基因的表达模式，我们构建了新的 IAA2::uidA(GUS)报告株系。观察转基因拟南芥的GUS染色模式发现，IAA2除了在维管组织表达外，还在生长素累积最多的地方表达，外源生长素处理能够强化这种表达。IAA2表达模式不同于已经报道的IAA7，IAA14，IAA17和IAA28。 3．用35S启动子过量表达野生型IAA2，也用双链RNA技术干涉内源IAA2，分别得到了35个和26个转基因拟南芥株系。对这些株系进行表型观察，没有发现明显的生长和发育异常。这两个实验进一步提示了IAA2基因功能的冗余性。 4．利用Bgl Ⅱ酶切位点，通过了三轮PCR反应，定点突变了IAA2蛋白结构域Ⅱ中的两个相邻的脯氨酸残基iaa2<'P65S>和iaa2<'P66L>。用35S启动子过量表达这两个定点突变的基因，发现转基因拟南芥菜在生长和发育上存在诸多明显缺陷。令人感兴趣的是，过量表达脯氨酸双突变(iaa2<'P65SP66L>，转基因植株的表型是正常的。 5．iaa2<'P65S>和iaa2<'P66L>转基因株系展示了多效性生长素相关的表型，主要包括，主根和下胚轴延伸的抑制，根和下胚轴的向地性缺陷，主根延伸和侧根诱导对外源生长素处理的敏感度下降，不定根数量增加，叶片上卷，顶端优势减弱等等，这些表型在其他Aux/IAAs基因中已经有所报道。另外，有些表型，如叶柄偏上生长、主根原基的发育异常，这些是IAA2突变后所特有的表型。这些结果说明IAA2在拟南芥生长和发育中既有冗余但又有独特的功能。 6．用荧光显微镜观察了5种融合蛋白在转基因拟南芥中的的荧光信号，发现EGFP-iaa2<'P65S>、ECFP-iaa2<'P65S>和ECFP-iaa2<'P66L>三者的荧光强度很强，均显著高于野生型EGFP-IAA2(近20倍)，说明脯氨酸单突变增加了IAA2蛋白的稳定性(转录抑制因子不易被降解了)，也同时产生了生长素相关的表型缺陷。 7．用Westem-blots检测了融合蛋白在转基因拟南芥中的累积，发现 ECFP-iaa2<'P65S>和。ECFP-iaa2<'P66L>大量累积，而野生型ECFP-IAA2只有微弱累积信号。在生长素处理下，ECFP-iaa2M<'P65S>和ECFP-iaa2<'P66L>很难被降解，野生型ECFP-IAA2很快被降解。这进一步证明脯氨酸单突变造成转基因株系表型缺陷是由于增加了IAA2蛋白的稳定性而引起的。 8．荧光显微观察和Western-blots检测表明，ECFP-iaa2<'P65SP66L>转基因拟南芥没有荧光信号，也没有融合蛋白累积。说明两个脯氨酸同时突变反而降低了IAA2的稳定型。整合起来，我们的实验说明结构域Ⅱ中的两个脯氨酸残基在IAA2蛋白稳定性中起双重作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

第一章文献综述

1.1生长素在植物生长发育中作用机理研究进展

引言

1.1.1生长素对拟南芥叶片发育的影响

1.1.2生长素对下胚轴伸长的影响

1.1.3生长素对植物早期发育的影响

1.1.4生长素对根发育的影响

1.1.5生长素对花器官形成和开花的影响

1.2IAA的内稳态

1.2.1 IAA的合成

1.2.2生长素运输

1.2.3 IAA的代谢

1.3生长素信号转导

1.3.1生长素受体

1.3.2 Aux/IAA

1.3.3 ARF

1.3.4 SCFTIR1

第二章材料和方法

2.1拟南芥种子

2.2质粒

2.3拟南芥生长条件

2.4IAA2 TILLING种子鉴定

2.5表达载体构建

2.5.1过量表达iaa2-1、iaa2-2、iaa2-3的IAA2基因突变序列

2.5.2IAA2基因启动子表达构建

2.5.3基于GatewayTM的IAA2表达载体构建

2.5.4基于GatewayTM的荧光共振能量转移表达载体构建

2.5.5基于GatewayTM的GUS C端和N端表达载体构建

2.6表型分析

2.6.1根、下胚轴长度

2.6.2根、下胚轴向地性

2.6.3根生长素抗性实验

2.6.4不定根数统计

2.6.5成年植株表型观察

2.7表达分析

2.7.1半定量检测mRNA表达量

2.7.2 GUS报告基因表达分析

2.7.3显微观察蛋白表达

2.7.4 Western-blots检测蛋白表达

2.8荧光共振能量转移方法研究蛋白之间互作

2.8.1荧光共振能量转移实验材料初步建立

2.8.2拟南芥杂交

2.9本文设计的引物和构建的载体

第三章结果和分析

3.1拟南芥IAA2 TILLING种子发现了三个突变体但都没有表型

3.1.1 IAA2基因TILLING种子遗传分析

3.1.2过量表达IAA2错误蛋白同样没有表型

3.2IAA2基因过量表达和RNA干涉IAA2基因并不引起表型表化

3.2.1 IAA2过量表达、RNA干涉转基因株系获得

3.2.2转基因株系没有表型

3.2.3转基因株系对生长素敏感

3.3拟南芥IAA2基因启动子功能研究

3.3.1拟南芥IAA2启动子的克隆和表达载体的构建

3.3.2 pIAA2L::GUS转基因株系获得

3.3.3 pIAA2L::GUS表达情况

3.4IAA2基因亚细胞定位

3.4.1IAA2 C端、N端融合转基因株系获得

3.4.2IAA2蛋白亚细胞定位

3.5IAA2 DomainⅡ的脯氨酸功能研究

3.5.1IAA2基因保守结构域Ⅱ的BglⅡ酶切位点有助于定点突变和回复突变

3.5.2 iaa2表达载体鉴定

3.5.3 pIAA2L控制的iaa2表达载体鉴定

3.5.4表达载体转化拟南芥

3.5.5突变体表型分析

3.6IAA2基因机理研究

3.6.1显微观察和western-blots方法检测突变体蛋白降解速度

3.6.2 GUS融合的表达载体构建来研究IAA2蛋白泛素化

3.6.3荧光共振能量转移活体研究蛋白互作

第四章讨论

4.1 IAA2研究背景

4.2IAA2在植物发育过程中高度表达

4.3 TILLING技术是一种高通量、低成本的反向遗传学研究方法

4.3.1 TILLING技术原理

4.3.2 TILLING技术的优点

4.3.3拟南芥TILLING种子的缺点

4.4简单、高效的Gateway重组克隆系统

4.4.1 Gateway重组克隆系统的原理

4.4.2 Gateway重组克隆系统的优点

4.4.3 pCAMBIA载体系统缺陷

4.5 IAA2蛋白在拟南芥生长和发育具有功能冗余性

4.6IAA2在拟南芥生长和发育具有一些独特的功能

4.7 IAA2保守结构域Ⅱ相邻的两个脯氨酸在蛋白稳定性上起到双重作用

4.8荧光共振能量转移活体检测蛋白互作

致谢

参考文献