百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2及其编码基因和探针

摘要

本发明公开了一种百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由如SEQ？ID？NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ？ID？NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲Aux/IAA2蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为利用基因工程技术调控百子莲生长素信号转导途径，从而达到控制其生长发育、器官形态建成的目的，为分子育种提供了理论依据，具有很大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及百子莲生长素信号转录调控蛋白及其编码基因和探针，具体涉及一种百 子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2及其编码基因和探针。

背景技术

内源激素对观赏植物生长发育及观赏性状调控具有重要的作用，生长素在植物体内 是唯一一种具有极性运输特征的内源激素。生长素的含量与分布关系到植株的生长与发 育速度及各器官组织的极性结构与空间形态。生长素的信号传导途径目前研究的较为清 楚，其中Aux/IAA是重要的生长素转录抑制因子，当它与生长素结合时会抑制生长素的 转录，降低生长素含量。

体细胞胚胎发生(体胚)是植物分子育种与离体快繁最有效的技术体系，已有研究 表明植物体胚诱导主要依赖于外源生长素调控，且外源生长素类物质毒莠定对单子叶球 根花卉体胚诱导具特效性。百子莲为热带多年生花卉，花量大、花期长、观赏价值高， 具有地下块茎组织。我们前期建立的百子莲体胚体系表明生长素信号对百子莲体胚诱 导、体胚形态、体胚数量与体胚成苗具有决定性作用。另外，应用外源调控物质打断生 长素极性运输对百子莲花期、植株矮化、花序形态均有明显的调控作用。因此，生长素 信号对花卉产业化生产与育种改良工作具有至关重要的作用。

Aux/IAA的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、玉米、葡萄、 蓖麻等。但对于观赏植物，尤其是球根花卉中，Aux/IAA的克隆、表达模式及蛋白序列 尚不清楚。目前，未有任何与百子莲Aux/IAA蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于填补百子莲Aux/IAA2基因的克隆、表达模式分析以及百子莲 Aux/IAA2蛋白的空白，提供了一种百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2，本发明 还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了 百子莲Aux/IAA2基因转化拟南芥后的生理效应及表达模式，为今后利用基因工程技术 对Aux/IAA2基因表达的时空特性进行调控，从而为体胚发生、株型调控提供了理论依 据，具有很大的应用价值。

第一方面，本发明提供了百子莲生长素信号转录调控蛋白，所述蛋白质是由如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列经过取 代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲生长素信号转录调控蛋白特征的蛋白 质。

优选的，所述蛋白质为SEQIDNO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQIDNO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性 质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

第二方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：(a)碱基序列如SEQIDNO.3第1～480位所示； 或(b)与SEQIDNO.3第1～480位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；或(c) 能与SEQIDNO.3第1～480位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQIDNO.3第1～480位所示的核酸序列中1～90 个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。

第三方面，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核 酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子 莲Aux/IAA2相关的核酸分子。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下 位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分 分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2蛋白编码序列”指编 码具有百子莲Aux/IAA2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3所示的第1～ 480位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.3所示的第1～480 位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序 列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.3所示的第1～480位核苷酸序列同源性 低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO.4所示的序列。该术语还包括与SEQID NO.3所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然百子莲Aux/IAA2蛋白的相同功能、SEQIDNO.3所示序 列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插 入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2”指具有百子莲 Aux/IAA2蛋白活性的SEQIDNO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然百子莲 Aux/IAA2蛋白相同功能的、SEQIDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并 不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端 添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行 取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个 氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百子莲Aux/IAA2蛋白的活性片段 和活性衍生物。

本发明的百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2的变异形式包括：同源序列、 保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百 子莲Aux/IAA2相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲Aux/IAA2蛋白 的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“百子莲Aux/IAA2保守性变异多肽”指与SEQIDNO.4所示的氨基酸 序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保 守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

发明还包括百子莲Aux/IAA2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与百子莲Aux/IAA2 相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种 技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已 知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸) 的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理 解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰 化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳 动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷 酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解 性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析百子莲Aux/IAA2基因产物的表达 模式，即分析百子莲Aux/IAA2基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在百子莲Aux/IAA2相关核苷酸序列的检测方法，包括用 上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的 产物，其中PCR扩增引物对应于百子莲Aux/IAA2相关核苷酸编码序列，并可位于该编 码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的百子莲Aux/IAA2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源 性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选百子莲Aux/IAA2相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与百子莲Aux/IAA2相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选百子莲cDNA 文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对百子莲Aux/IAA2相关的全部或部分做放 射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自百子莲的文库。构建来自感兴趣的 细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的 cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可 以识别与百子莲Aux/IAA2相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的百子莲Aux/IAA2相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、 重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸 序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已 知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需 要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有 关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加 以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WHFreemanCo.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.AmChem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可

以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加 以连接以产生全长的分子。

利用本发明的百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2，通过各种常规筛选方法， 可筛选出与百子莲Aux/IAA2蛋白相关发生相互作用的物质，或抑制剂与拮抗剂等。

百子莲观赏价值极高，应用广泛，其花葶挺拔是优良的鲜切花品种，也是除了玫瑰 以外最能表达爱意的爱情花，其市场需求也越来越大。本发明首次克隆百子莲植物体内 生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2的编码序列，并将其转化到模式植物拟南芥中，采 用荧光实时定量PCR的方法分析Aux/IAA2基因在拟南芥中的生理效应和表达模式，为 今后利用基因工程技术调控Aux/IAA2基因的时空表达，从而为体胚快繁、新品种选育 方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特 征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的百子莲Aux/IAA2基因与马铃薯Aux/IAA13基因mRNA的核苷酸 序列的同源比较(GAP)结果；

图2为本发明的百子莲Aux/IAA2蛋白与海枣Aux/IAA22蛋白的氨基酸序列的同源 比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

图3为野生型与Aux/IAA2转基因拟南芥植株生长状况表型观察；

图4为野生型与Aux/IAA2转基因拟南芥Aux/IAA2基因表达定量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、百子莲Aux/IAA2基因的克隆

1.植物材料的获得

取百子莲成年苗叶片组织，用于提取RNA；

2.RNA的抽提

用“RNApreppure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA(Trizol：Invitrogen)，用 甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(ThermoScientificNANODROP 1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据百子莲转录组测序(RNA-seq)的蛋白功能注释结果，获得百子莲Aux/IAA2 基因核心片段。采用RACE方法(SMARTer^TMRACEcDNAAmplificationKit：Clonetech) 进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录(PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit：宝生物 工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物Aux/IAA2F(SEQIDNO.1) 和Aux/IAA2R(SEQIDNO.2)进行PCR，扩增得到254bp片段，回收并连接到 pMD19-TSimplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标 记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA) 上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比 对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的油棕、海枣、小果野芭 蕉的Aux/IAA基因的同源性很高，初步认为它是一个Aux/IAA基因；

(2)3′RACE

二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。

第一轮：UPM+3’-GSP1(5′-GGTCAAGGTCAACCACGCAGGAAAAT-3′)(SEQID NO.5)

第二轮：NUP+3’-GSP2(5′-GAGGACAAAGATGGGGATTGGATGCT-3′)(SEQID NO.6)

UPM和NUP为试剂盒提供。3′RACE得到百子莲Aux/IAA2的3′末端序列(475 bp)，回收，连接到pMD19-TSimplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物， 采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪 (Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋 白与已知的小果野芭蕉、水稻、油棕的Aux/IAA基因的同源性很高；

(3)5′RACE

以5′RACEreadycDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增，

第一轮：UPM+5’-GSP1(5′-AGCATCCAATCCCCATCTTTGTCCTC-3′)(SEQID NO.7)

第二轮：NUP+5’-GSP2(5′-GGTTGACCTTGACCGTCCTTGCTTTA-3′)(SEQID NO.8)

UPM和NUP为试剂盒提供。5′RACE得到百子莲Aux/IAA2基因的5′末端序列 (360bp)，回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得的序列 的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从百子莲中新得到的 Aux/IAA2基因的确为一个生长素转录抑制因子相关的基因，将测序结果结合NCBI的 ORFFinding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了百子莲Aux/IAA2基因的 起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特 异性引物ORF-F(5′-ATGAGAGATCCAATGGAAGGCGAAAC-3′)(SEQIDNO.9)， ORF-R(5′-TTACCCCCATGGAACATCTCCAACA-3′)(SEQIDNO.10)，以百子莲cDNA 为模板进行PCR，扩增得到480bp百子莲Aux/IAA2蛋白的全长编码序列(SEQID NO.3)。

实施例2、百子莲Aux/IAA2基因的序列信息与同源性分析

本发明新的百子莲Aux/IAA2基因全长开放读码框序列为480bp，详细序列见SEQ IDNO.3所示序列。根据开放读码框序列推导出百子莲Aux/IAA2蛋白的氨基酸序列， 共159个氨基酸残基，分子量为18.07kDa，等电点(pI)为6.15，详细序列见SEQIDNO.4 所示序列；

将百子莲Aux/IAA2的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序 在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索， 结果发现它与马铃薯Aux/IAA13基因(登录号：XM_006342346.1)在核苷酸水平上具有 96％的相同性，如图1所示(Query：百子莲Aux/IAA2的编码基因序列；Sbjct：马铃薯 Aux/IAA13的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它与海枣Aux/IAA22基因(登录号： XP_008788132.1)也有61％的一致性和68％的相似性，如图2所示(Query：百子莲 Aux/IAA2蛋白的氨基酸序列；Sbjct：海枣Aux/IAA22蛋白的氨基酸序列)。由此可见， 百子莲Aux/IAA2基因与其它已知物种的Aux/IAA基因无论从核酸还是蛋白水平上都存 在较高的同源性。

实施例3、百子莲Aux/IAA2基因转化模式植物拟南芥

1.含目的基因(百子莲Aux/IAA2基因)的表达载体的构建

根据百子莲Aux/IAA2基因全长编码序列(SEQIDNO.3)，设计扩增在完整编码阅 读框的引物，并在上下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)， 以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将百子莲 Aux/IAA2基因的编码区序列连接至中间载体(如pMD19-T)中进行测序，再将测序正 确的百子莲Aux/IAA2基因的编码区序列进一步克隆到表达载体中(如pHB)，在鉴定 好阅读框正确的前提下将其转入根癌农杆菌中(如GV3101)，并对转化后的农杆菌进行 PCR鉴定，以保证含有百子莲Aux/IAA2基因的植物表达载体成功转化入根癌农杆菌中。

2.根癌农杆菌介导转化拟南芥

(1)预摇农杆菌：挑阳性单克隆至25ml含50mg/LKan、50mg/L庆大霉素、25mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；

(2)扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1∶100扩培至含400mLKan抗性YEP培 养基中，28℃，200rpm，培养13-16h，培养至吸光度OD600达到1.5-2.0之间收菌， 收菌条件是23℃，5000rpm，8min；

(3)转化植株：(需要在转化前一天或是转化当天剪去植株上所有的角果和盛开以 及露白的小花)配制500mL含5％蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将收集的农杆 菌沉淀悬起，摇匀，向剩余的蔗糖溶液中加入0.04％(v/v)的SilwetL-77与10μL6-BA(母 液为1mg/mL)，搅匀，在转化前将二者混匀，将植株茎部及花序浸泡在菌液中50s，取 出沥干菌液，放入一次性塑料袋中，密封保湿。将所有植株转化完毕后，罩上黑盒子， 避光培养24h。之后取出植株，将植株直立放置，浇水培养，保证植株水分充足。

3.转基因阳性株系的筛选

转化后的植株待角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一 周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因T0代 种子并播种于穴盘中，用0.05％(v/v)草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得T1代转基因植 株，持续筛选直至获得T3代纯合体转基因植株。野生型与Aux/IAA2转基因拟南芥植 株的表型具有显著性差异(图3)；Aux/IAA2转基因植物生长明显缓慢与野生型植株， 说明Aux/IAA2对生长素具有负调控作用。

4.转基因拟南芥植株Aux/IAA2基因表达差异

剪切拟南芥野生型与Aux/IAA2转基因植株的叶片0.2g，提取RNA、制备cDNA并 进行实时定量PCR分析。Real-timePCR中Aux/IAA2基因定量分析的特异性引物为 qAUX/IAA2F(5′-GACGATTGTGGTGTTGAT-3′)(SEQIDNO.11)，引物qAUX/IAA2 R(5′-CCATTGGAGCAAGTTCTT-3′)(SEQIDNO.12，内参基因为拟南芥UBQ5基因， 引物为UBQ5-F(5′-GACGCTTCATCTCGTCC-3′)(SEQIDNO.13)，UBQ5-R (5′-CCACAGGTTGCGTTAG-3′)(SEQIDNO.14)。采用2^-ΔΔCt法作相对定量分析，结 果表明转基因拟南芥中Aux/IAA2的表

达量较高，是内参基因UBQ5的3.4倍，是野生型植物的5838倍(图4)。表明 Aux/IAA2没有在野生型植株中表达。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特 定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。