ARL1调控水稻不定根发育的基因表达谱与蛋白表达谱分析

摘要

水稻不定根属于胚后发育的器官，是由根茎结合部的中柱鞘原初静止细胞经过不断的分裂与分化形成的。生长素(IAA)长久以来被认为是诱导细胞分裂的主要植物激素，可以激活维管束的原初木质部对应的中柱鞘细胞进行非对称分裂，导致根原基的形成。目前，尽管生长素信号转导与细胞分裂周期的研究分别取得了很大进展，但生长素信号诱导水稻不定根原基发生的早期分子机制仍不清楚。本研究利用水稻不定根缺失突变体arll从整个基因组与蛋白组水平上考察进行了野生型与突变体根茎结合部中柱鞘细胞的基因表达变化，以期探索生长素信号诱导水稻不定根原基发生的分子机理。主要结果如下： 1．通过对水稻arll突变体与中花-11根茎结合部的组织片分析，发现突变体在鞘叶节与第一节均无不定根原基产生，并且外源NAA诱导也不能产生不定根原基，由于ARL1受生长素调控，说明ARL1基因是联系生长素信号转导与早期不定根原基发生的关键基因。 2．利用LCM取样与水稻Affymetrix基因芯片进行突变体与野生型根茎结合部中柱鞘细胞群的基因表达差异分析，发现控制细胞周期G1至S期转化的基因如E2Fa、D type cyclin、cdc2、CycA1；1以及参与S期DNA复制的基因H3、H4、OR．C、CDC6b、CDT2、MCMs、PCNA与NAF/CAF等基因在突变体中柱鞘细胞中的表达都显著下调，说明ARL1基因突变以后，可能阻断了根茎结合部中柱鞘原初静止细胞由G1期至S期的转化，影响了S期DNA的复制过程，从而抑制了水稻不定根原基的发生。 3．通过野生型与突变体的芯片比较分析，发现生长素信号转导的早期响应基因AUX/TAA、TIR1与ARF在arll中柱鞘细胞的表达呈现下降趋势；植株体内生长素的内向转运体AUX1以及外向转运体PIN1基因的表达也被强烈抑制；此外，促进生长素与氨基复合物的合成酶GH3的表达也呈下降趋势。说明ARL1基因突变后也影响了水稻根茎结合部中柱鞘细胞内的生长素代谢的平衡，可能引起了对ARL1上游生长素信号转导的负反馈调节。 4．通过基因芯片分析以及RT-PCR验证，发现规定细胞分化特性的标记基因如具有WUSCHEL Homeobox domain结构域的同源基因(WOX)与SCR基因在野生型的表达都呈显著上调，因为 ARL1基因突变后并不影响侧根原基的发生，说明中柱鞘原初细胞能够正常分裂仅是不定根原基发生的一个必要条件，控制细胞分化特性的标记基因如WUS与SCR的表达也是影响不定根发育的重要因素。 5．通过野生型与突变体根茎结合部的2D DIGE蛋白表达以及质谱的PMF分析并结合单克隆抗体的免疫分析，发现控制细胞G1至S期转化的蛋白质以及参与S期DNA修复的一些酶类如G1 to s phase transition protein 1homolog/EF-1-alpha-related GTP-binding protein、high mobility group protein、cellcycle switch protein、D type cyclin、CycA1：1、Histone 3、cell cycle ATPase、replication factor C110 kDa subunit、DNA-directed RNA polymerase与DNA repairprotein在arll突变体根茎结合部中柱鞘中的表达都被明显抑制；此外生长素信号转导的早期响应蛋白F-box containing protein TIRl的在arll突变体中也被抑制。这些结果与芯片杂交的结果相吻合，进一步说明了ARL1基因不但在基因转录水平控制了根茎结合部中柱鞘细胞由G1至S期的转化，并且也参与了控制该时期的一些关键蛋白的表达。 6．G信号的代谢可能是另一生长素信号转导的途径，可促进侧根以及其他一些分生区的细胞分裂。本研究中，芯片与2D DIGE-PMF蛋白的分析结果都表明G1 to S phase transition protein 1 homolog/EF-1-alpha-related GTP-binding protein、sall GTP-binding protein以及其他一些相关的GTPase在突变体中柱鞘细胞中其基因与蛋白水平上都呈下调；其中G1 to S phase transition protein 1homolog/EF-1-alpha-related GTP-binding protein基因在野生型中是特异表达的，arll突变体中没有检测到任何表达信号，并且该基因在基因转录与蛋白表达水平上都受外源NAA的强烈诱导，说明G信号也参与了水稻不定根原基的起始，但在调控水稻不定根原基起始过程中与ARL1基因的关系目前还不明确，有可能与ARL1基因共同调控着根茎结合部的中柱鞘细胞由G1至S期的转化，这一方面还需要进一步的探索与研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

致谢

第一章文献综述

第一部分植物不定根发育的分子机理研究进展

1.1.不定根的形态结构和发生发育过程

1.2.细胞分裂与不定根的发生发育

1.3.特定中柱鞘细胞的极性决定与根系的发生发育

第二部分生长素信号调控植物根系发育的分子机制研究进展

2.1.生长素调控植物根系发育的分子机制

2.2.生长素调控细胞分裂的分子机制

2.3.Heterotrimeric G protein信号转导在根系发育中的分子机制

第三部分激光捕获显微切割技术(LCM)与Affymetrix基因芯片在组织特异基因表达中的应用

3.1.激光捕获显微切割技术原理以及应用

3.2.LCM在植物组织特异基因表达研究中的应用

3.3.Affymetrix基因芯片技术原理以及应用

3.4.Affymetrix基因芯片在植物组织特异基因表达研究中的应用

第四部分蛋白质荧光双色标记技术(2D DIGE)及其应用

4.1.蛋白质双向电泳技术的原理与应用

4.2.蛋白质组学在植物中的应用进展

第二章水稻根茎结合部中柱鞘细胞群以及不定根与侧根原基的激光捕获显微切割(LCM)

1材料与方法

1.1.材料

1.2.方法

2.结果与讨论

2.1.水稻根茎结合部中柱鞘体细胞群的LCM分离

2.2.水稻不定根与侧根原基细胞群的LCM分离

2.3.LCM分离的细胞群的准确性分析以及miniRNA的质量鉴定

3.小结与讨论

第三章水稻根茎结合部中柱鞘细胞群的基因表达谱分析

1.材料与方法

1.1.材料

1.2.方法

2.结果与讨论

2.1.水稻arl1突变体与野生型根茎结合部的中柱鞘细胞群基因表达的变化

2.2.ARL1基因突变阻断了根茎结合部中柱鞘细胞的G1/S期的转化过程进而抑制了水稻不定根的发生

2.3.ARL1基因是联系生长素信号转导与不定根原基发生的关键基因

2.4.特定中柱鞘细胞分裂的激活与WUSCHEL等细胞分化的标记基因的表达是不定根原基发生的必要条件

2.5.ARL1基因调控水稻不定根原基发生的可能的代谢途径

3.小结

第四章水稻根茎结合部的特异组织细胞2D-DIGE蛋白表达分析

1材料与方法

1.1.材料

1.2.方法

2.结果与讨论

2.1.arl1突变体与中花-11野生型不同处理的2D DIGE实验设计

2.2.水稻arl1突变体与野生型的根茎结合部蛋白表达谱的2D DIGE分析

2.3.不定根有关的差异表达蛋白的MALDI-TOF/FOF-MS PMF鉴定

2.4.特异表达蛋白的免疫杂交分析

3.小结

第五章结论与展望

1.结论

2.展望

参考文献