蝶蛹金小蜂毒液的生理功能及活性成分分离纯化的研究

摘要

本文在蝶蛹金小蜂毒液生理功能和生化特性的研究基础上，对蝶蛹金小蜂毒液引起的寄主血细胞生理变化进行了进一步研究。同时，本文探索和设计了部分及完全分离纯化具有抑制细胞延展和包囊的毒液活性组分的方法。实验结果概述如下： 1 毒液对不同龄期菜粉蝶血细胞延展和包囊的影响寄主免疫反应主要包括细胞和体液免疫，毒液在不同龄期寄主及血淋巴浆液有无的处理条件下对寄主细胞延展影响不同。在0.5 h，毒液处理对细胞延展影响差异显著，说明毒液，细胞免疫、体液免疫互作显著，作用有累加；但4 h差异不显著，说明3者无累加作用。这可能和细胞延展反应的特性有关。毒液、不同龄期、血淋巴浆液 3 因子共同作用不影响细胞包囊，这可能和包囊反应是多因子的复杂作用有关。 2毒液对细胞凋亡、死亡、存活的影响应用细胞早期凋亡在细胞膜上的变化，即细胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻作为检测指标，对蝶蛹金小蜂的毒液是否影响不同龄期的寄主血细胞凋亡、死亡、存活进行了检测。结果表明毒液处理后非寄生期的高龄幼虫、预蛹的血细胞的凋亡、死亡、存活变化无规律。高龄幼虫血细胞有时凋亡率下降，但是不提高存活率；死亡率有时上升或者不变，与对照差异不显著。预蛹血细胞有时凋亡率不变或者下降、有时存活率上升或不变，对死亡率不影响。毒液处理的化蛹12 h、24 h蛹的血细胞凋亡率下降与对照差异显著；存活率上升与对照差异显著。这说明毒液显著抑制了细胞的早期凋亡，提高了细胞的存活率，这可能有利于寄生蜂的发育。 3毒液对细胞颗粒度和大小的影响流式细胞仪可以分析细胞大小和颗粒度，对毒液处理的不同龄期的菜粉蝶血细胞的大小和颗粒度进行研究发现，毒液处理的高龄幼虫、预蛹血细胞1 h，细胞颗粒度增大，与对照差异显著；大小变化不大与对照差异不显著。化蛹12 h毒液处理0.5 h后血细胞颗粒度减少和对照差异显著；大小变化不大和对照差异不显著。化蛹12 h蛹毒液处理1 h及化蛹24 h蛹毒液处理4 h的蛹血细胞变大，与对照差异显著；颗粒度变化不大与对照差异不显著。这些变化和细胞凋亡时细胞大小和颗粒度的变化不同，间接说明不同龄期的菜粉蝶血细胞可能没有凋亡或者凋亡率下降。 4毒液蛋白部分纯化物对菜粉蝶蛹血细胞延展，包囊的影响寄生蜂在产卵的同时也向寄主注射毒液，毒液抑制了寄主的免疫反应，因此得以成功寄生，卵发育为成蜂。毒液是重要的寄主免疫反应压迫因子。蝶蛹金小蜂的毒液抑制细胞的延展和包囊。但是毒液蛋白种类丰富，对毒液中究竟是哪个组份有活性尚未研究。本文设计了几种方法部分纯化毒液蛋白，以便找到有活性的蛋白。实验结果表明，部分纯化法可以显著提高毒液的活性。对部分纯化物进行非变性电泳，发现了分子量为98 kDa蛋白；同时进行的变性电泳，发现了分子量为24 kDa的蛋白。此蛋白很有可能是毒液的活性因子。 5毒液纯化及分离物对菜粉蝶蛹血细胞延展和包囊的影响没有共生病毒的膜翅目寄生蜂的毒液在调节寄主的免疫压迫反应和寄主调控中有重要作用。目前对这些寄生蜂的毒液活性组分了解不多，特别是涉及到寄主细胞免疫功能的组分。报道了菜粉蝶Pieris rapae内寄生蜂蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒液组分中分子量为24.1 kDa的Vn.11的分离和特性。Vn.11通过硫酸铵沉淀和阴离子色谱纯化分离得到。用SDS-PADE检测了Vn.11的纯度。Vn.11与粗提毒液一样，在离体条件下可以显著抑制寄主血细胞的延展和包囊。这表明Vn.11是粗提毒液中一个实际压迫寄主免疫功能的组分。

目录

文摘

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前言

声明

致谢

第一章寄生蜂毒液的研究进展

1毒液的生理功能

1.1对寄主细胞免疫的影响

1.2对寄主体液免疫的影响

1.3对寄主发育的影响

1.4麻痹及阻断神经的作用

1.5对寄主营养代谢的影响

1.6毒液的其他活性

2毒液活性成分的研究进展

2.1毒液蛋白

2.2毒液肽

3毒液与病毒

4毒液研究方法的进展

5毒液应用展望

第二章毒液对不同龄期菜粉蝶血细胞延展和包囊的影响

1材料和方法

1.1昆虫饲养

1.2毒液粗提

1.3不同处理及龄期的菜粉蝶血细胞延展和包囊

1.4统计分析

2结果

2.1毒液对不同龄期菜粉蝶血细胞延展的影响

2.2毒液对不同龄期菜粉蝶细胞包囊的影响

3讨论

第三章毒液对不同龄期菜粉蝶血细胞凋亡、死亡和存活的影响

1材料和方法

1.1昆虫饲养

1.2毒液粗提

1.3毒液处理不同龄期菜粉蝶血细胞

1.4磷脂酰丝氨酸检测(Phosphatidylserine Membbrane Asymmetry Assays)

1.5流式细胞术分析

1.6统计分析

2结果

2.1不同龄期菜粉蝶血细胞总细胞群的凋亡率、死亡率、存活率

2.2不同龄期菜粉蝶血细胞R1群细胞的凋亡率、死亡率、存活率

2.3不同龄期菜粉蝶血细胞R2群细胞的凋亡率、死亡率、存活率

3讨论

3.1毒液对细胞凋亡的抑制作用

3.2毒液对不同细胞特性的细胞群凋亡的抑制作用

3.3毒液抑制不同龄期寄主细胞凋亡的作用与最合适的寄生龄期

第四章毒液对不同龄期菜粉蝶血细胞颗粒度和大小的影响

1材料和方法

1.1昆虫饲养

1.2毒液粗提

1.3毒液处理不同龄期菜粉蝶血细胞

1.4流式细胞术

1.5统计分析

2结果

2.1不同龄期菜粉蝶血细胞总细胞群的大小、颗粒度

2.2不同龄期菜粉蝶血细胞R1群细胞的大小、颗粒度

2.3不同龄期菜粉蝶血细胞R2群细胞的大小、颗粒度

3讨论

3.1总细胞群的特性

3.2R1群细胞的特性

3.3R2群细胞的特性

3.4毒液的细胞毒作用

第五章蝶蛹金小蜂毒液蛋白部分纯化物对菜粉蝶蛹血细胞延展、包囊的影响

1材料和方法

1.1昆虫饲养

1.2毒液蛋白粗提

1.3饱和(NH4)2SO4沉淀毒液蛋白

1.4有机溶剂沉淀毒液蛋白

1.5等电点法沉淀毒液蛋白

1.6加热法提纯1.3法所得毒液蛋白

1.7超滤法分离1.3法所得毒液蛋白

1.8部分纯化物对菜粉蝶蛹血细胞延展和包囊的影响

1.9毒液分离物纯度的检测

1.10毒液蛋白活性成分的初步确定

2结果

2.1毒液蛋白部分纯化物对血细胞延展和包囊的影响

2.2电泳

3讨论

3.1毒液部分纯化法

3.2毒液部分纯化物的活性比较

3.3毒液活性成分初步推断

第六章毒液纯化及分离成分对细胞延展和包囊的研究

1材料和方法

1.1昆虫饲养

1.2毒液粗提

1.3硫酸铵沉淀

1.4阴离子交换柱分离毒液蛋白

1.5 SDS-PAGE纯度分析

1.6纯化物活性检测

1.7统计分析

2结果

2.1毒液纯化

2.2电泳分析

2.3分离物的活性

3讨论

第七章总讨论

参考文献

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