用于检测转基因NOS基因片段的DNA生物传感器的研究

摘要

转基因农作物研究的迅速发展，在给人类带来巨大贡献的同时，也带来了一系列严重的问题，这就使得对转基因农作物的检测迫在眉睫。近几年来，基于核酸杂交的DNA生物传感器发展迅速。DNA生物传感器以其体积小、成本低、分析速度快、灵敏度高、选择性好等优点，在转基因农产品检测领域具有巨大的潜力和良好的前景。基于此，本研究以转基因植物中常用的根癌农杆菌终止子基因片段为检测对象，利用DNA生物传感器技术实现对NOS靶基因序列片段的定量检测。
　　 本研究使用电化学阻抗谱技术比较了巯基修饰的ssDNA探针直接自组装法、巯基丙酸自组装法和生物素—亲和素法三种ssDNA探针固定方法，实验结果表明三种ssDNA探针固定方法均能够实现对cDNA靶序列的有效检测。以电极捕获待测溶液中的cDNA靶序列后的电子传递阻抗的增幅来表征ssDNA探针固定方法的优劣，得出使用巯基丙酸自组装法固定ssDNA探针的效果最好。
　　 本研究使用巯基丙酸自组装法固定ssDNA探针制备了用于检测待测溶液中靶基因片段的电化学DNA生物传感器。在对MPA自组装时间和ssDNA探针固定时间进行了优化实验条件下，待测溶液中cDNA浓度在1.0×10—7mol/L～1.0×10—10mol/L范围时，其浓度的对数值和ssDNA/Au电极与dsDNA/Au电极循环伏安峰电流差值的变化值成线性相关关系，相关系数r=0.9822，检测下限达到了8.1×10—11 mol/L。
　　 为了进一步提高DNA生物传感器的灵敏度，降低检测限，将磁性纳米粒子和DNA生物传感器有机结合到一起。通过使用电化学阻抗谱法及循环伏安法对整个实验过程进行了表征，并设计了此基于磁性纳米粒子的DNA生物传感器的等效电路，并进行了验证。对于此基于磁性纳米粒子的DNA生物传感器，当待测溶液中cDNA浓度在1.0×10—8 mol/L～1.0×10—11 mol/L范围时，其浓度的对数值和10 Hz频率下的电极的阻抗模值的差值成线性相关关系，相关系数r=0.9875，检测下限达到了2.95×10—12mol/L。

目录

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致谢

第一章转基因农作物及其检测方法

1.1转基因农作物现状及其安全性

1.1.1人口问题与粮食问题

1.1.2转基因作物的种植现状

1.1.3转基因农作物市场现状

1.1.4转基因农作物的安全性问题

1.1.5世界各国对转基因农作物产品安全性问题的态度

1.1.6转基因食品检测的必要性

1.2建立在蛋白质水平上的检测方法

1.2.1 Western印迹方法

1.2.2 ELISA方法

1.2.3免疫学方法检测转基因食品的局限性

1.3建立在核酸水平上的检测方法

1.3.1 PCR的基本原理

1.3.2靶序列的选择

1.3.3巢式PCR和半巢式PCR

1.3.4 PCR产物的检测方法

1.3.5 PCR技术定量检测转基因食品

1.3.6建立在DNA水平上检测方法的局限性

1.4其他检测方法

1.4.1近红外光谱方法

1.4.2 X-射线荧光检测

1.5小结

第二章DNA生物传感器在转基因农产品检测中的应用

2.1生物传感器概述

2.2 DNA生物传感器

2.2.1 DNA固定方法

2.2.2检测方法

2.3纳米材料在DNA生物传感器中的应用

2.3.1纳米材料用于辅助DNA固定

2.3.2纳米材料用于信号放大

2.4磁性材料在DNA生物传感器中的应用

2.4.1磁性纳米粒子的性质

2.4.2磁性材料在DNA生物传感器领域中的研究应用

2.5小结

第三章电化学DNA生物传感器定量检测转基因NOS基因片段

3.1引言

3.2实验仪器及试剂

3.3实验方法

3.3.1三种ssDNA探针固定方法的比较

3.3.2电化学DNA生物传感器定量检测转基因NOS基因片段

3.4结果与讨论

3.4.1三种ssDNA探针固定方法的比较

3.4.2 MPA自组装法固定条件的选择

3.4.3电化学循环伏安法表征MPA自组装法固定及杂交过程

3.4.4定量检测NOS基因片段

3.4.5特异性

3.4.6传感器的再生

3.5小结

第四章基于磁性纳米粒子的电化学DNA生物传感器的研究

4.1引言

4.2实验仪器及试剂

4.3实验方法

4.3.1 ssDNA探针固定及磁分离

4.3.2表面修饰有亲和素的金电极的制备

4.3.3金电极表面磁性纳米粒子的修饰

4.3.4电化学阻抗谱检测

4.3.5循环伏安检测

4.4结果与讨论

4.4.1磁性纳米粒子的使用

4.4.2电化学阻抗谱技术表征亲和素固定及检测过程

4.4.3 DNA生物传感器的等效电路

4.4.4电化学循环伏安法表征亲和素固定及检测过程

4.4.5定量检测生物素标记的NOS基因片段

4.4.6特异性

4.5小结

第五章结论与展望

5.1课题总结

5.2研究展望

参考文献

作者简介