竹叶特征性黄酮类化合物研究——单体制备、抗氧活性及其血管保护作用研究

摘要

本文以竹叶中特征性黄酮类化合物为研究对象，对四个竹叶碳苷黄酮的大鼠体内代谢行为进行了探索，得到了其吸收形式、吸收部位、代谢方式以及时相变化的信息，为竹叶抗氧化物(AOB)的人体安全性评价提供参数和依据。采用HPLC制备等技术，从AOB中分离制备两类特征性的黄酮单体，即四个碳苷黄酮(荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷)和一个多甲氧基黄酮(苜蓿素)。然后，以异荭草苷和苜蓿素为代表，选取木犀草苷、木犀草素和芹菜素为对照，采用Rancimat法、DPPH法、FRAP法以及化学发光法等六种抗氧化性能评价方法，探讨黄酮糖苷元与糖苷、碳苷与氧苷、甲基化和非甲基化的结构特征与其抗氧化和抗自由基活性之间的量效和构效关系。最后，采用兔离体主动脉环灌流模型，从高钾和苯肾上腺素(PE)预收缩两条途径研究竹叶黄酮对PDC和ROC的抑制作用，对KCl浓度—效应曲线及PE引起细胞内钙释放和外钙内流所引发血管收缩作用的影响，对高钾和鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲基蓝预处理后的作用，对环氧合酶抑制剂吲哚美辛预处理后的作用，以及对一氧化氮合酶抑制剂L—NAME预处理后的作用；并用硝苯地平作为阳性对照药，研究竹叶黄酮的协同增效作用以及在细胞外有无钙离子存在的情况下对血管舒张因子NO释放量的影响，观察其对离体兔胸主动脉环的舒张血管效应，探讨可能的作用机制。主要研究结果归纳如下：
　　 (1)采用大鼠灌胃AOB的体内代谢模型，通过对主要脏器及消化道排泄物中目标化合物的分析检测，探讨碳苷黄酮的吸收形式、吸收部位、排泄方式以及随时相的变化，初步探明四种竹叶碳苷黄酮不经血尿途径吸收和代谢，而是经胃肠道途径进行代谢，与文献报道的氧苷黄酮的常规代谢方式存在明显差异。
　　 (2)以5升AOB浓缩液(固形物含量≥20％)为原料，通过柱层析(AB—8大孔吸附树脂)法得到6.5g富含碳苷黄酮的馏分和174g富含苜蓿素的馏分，然后采用制备型HPLC法分别从上述馏分中分离四种碳苷黄酮和苜蓿素，并用溶析结晶法和膜透析法纯化，分别得到荭草苷49mg、异荭草苷142mg、牡荆苷15mg、异牡荆苷62mg和苜蓿素3.09g，纯度均大于90％。
　　 (3)Rancimat法测得在添加量为0.02—0.05％时，五种黄酮试样抗山茶油氧化的性能依次为：木犀草素＞苜蓿素＞木犀草苷＞芹菜素＞异荭草苷；DPPH法测得其清除DPPH'的IC50为0.089—105.328 mmol/L，活性强弱顺序为：木犀草素≈异荭草苷＞木犀草苷＞＞苜蓿素＞＞芹菜素；FRAP法测得当添加量为0.02—0.1mmol/L时，五种试样的铁还原能力为：异荭草苷＞木犀草素≈木犀草苷＞苜蓿素＞芹菜素；化学发光法研究表明，其清除O'2—的能力为苜蓿素＞木犀草苷＞异荭草苷＞木犀草素＞＞芹菜素，IC50值范围为0.05—10.59mmol/L；清'OH能力为木犀草素＞木犀草苷＞苜蓿素＞异荭草苷＞＞芹菜素，IC50值为0.24—691.03mmol/L；清H2O2能力为苜蓿素＞木犀草苷＞木犀草素＞异荭草苷＞＞芹菜素，IC50值为0.37—130.58 mmol/L。
　　 (4)采用兔离体主动脉环灌流模型，观察竹叶黄酮(总黄酮含量≥50％)对血管环的直接作用，发现竹叶黄酮对PE和高钾引起的预收缩血管环具有舒张作用，并呈浓度依赖关系。提示竹叶黄酮可能抑制了高钾和PE引起的外钙内流或者是抑制了细胞内两种不同钙池的钙释放，从而降低了细胞内钙离子的浓度而产生血管舒张作用。且此作用表现为非内皮依赖，表明竹叶黄酮是直接作用于血管平滑肌细胞而产生作用。对比人体脐带静脉内皮细胞株在胞外有无钙离子时NO的释放量，说明胞外钙离子只是增强了其产生NO的能力。加入一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L—NAME和鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂亚甲基蓝后，竹叶黄酮的扩血管作用明显减弱，揭示其舒张血管的作用是通过NO介导途径，因此推论NO—sGC—cGMP途径可能介导了竹叶黄酮的舒张血管作用。竹叶黄酮还显示出与硝苯地平(阳性对照药物)的协同增效作用，用环氧合酶抑制剂吲哚美辛(10μmol/L)预处理，当竹叶黄酮试样浓度大于3000μg/mL时、对PE预处理的离体血管环具有显著的舒张效果(p＜0.05，p＜0.01)，显示高浓度的竹叶黄酮舒张血管作用与环氧酶(通过产生前列腺素)有一定的关系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章绪论

1.1竹叶

1.2黄酮类化合物(类黄酮)

1.2.1类黄酮的吸收和代谢

1.2.2类黄酮的分离、纯化及单体制备

1.2.3类黄酮舒张血管作用的研究进展

1.2.4类黄酮的抗氧化活性

1.3竹叶黄酮

1.3.1竹叶黄酮的结构特征

1.3.2竹叶黄酮的提取与分离

1.3.3竹叶黄酮的生物学功效

1.4本学位论文研究的主要内容及其学术意义

第二章竹叶黄酮的体内代谢途径初探

前言

2.1实验材料与方法

2.1.1材料与试剂

2.1.2主要仪器与设备

2.1.3实验方法

2.2结果与分析

2.2.1 HPLC分析测试条件的优化

2.2.2血样预处理条件的确定

2.2.3竹叶碳苷黄酮在组织器官中的分布

2.2.4碳苷黄酮的胃肠道代谢途径

2.2.5碳苷黄酮的排泄实验

2.2.6碳苷黄酮的吸收途径初探

2.3讨论

第三章 竹叶特征性黄酮成分的分离制备

前言

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2试剂药品

3.1.3仪器设备

3.1.4实验方法

3.2结果与分析

3.2.1 AB-8大孔吸附树脂的部位分离

3.2.2四种碳苷黄酮的HPLC分离制备

3.2.3碳苷黄酮的纯化与二次制备

3.2.4苜蓿素的HPLC分离制备

3.2.5苜蓿素的纯化

3.2.6碳苷黄酮和苜蓿素的结构解析

3.3讨论

第四章竹叶特征性黄酮类成分的抗氧化活性研究

前言

4.1材料与方法

4.1.1药品和试剂

4.1.2仪器设备

4.1.3实验方法

4.1.4数据处理

4.2结果与分析

4.2.1类黄酮的抗油脂氧化能力

4.2.2类黄酮清除DPPH自由基的能力

4.2.3类黄酮的铁还原能力

4.2.4类黄酮的清O.2-能力

4.2.5类黄酮的清.OH能力

4.2.6类黄酮清除H2O2的能力

4.3讨论

第五章竹叶黄酮血管舒张作用的离体实验研究

前言

5.1材料与方法

5.1.1实验动物

5.1.2试样及阳性对照

5.1.3药品和试剂

5.1.4仪器设备

5.1.5动物饲养条件

5.1.6实验方法

5.1.7数据处理

5.2结果与分析

5.2.1离体兔胸主动脉环的最佳前负荷

5.2.2血管内皮除去与否的乙酰胆碱法鉴定结果

5.2.3累计给药对PE预收缩引起的血管舒张作用

5.2.4累计给药对高钾预收缩引起的舒张作用

5.2.5竹叶黄酮对抗苯肾上腺素(PE)的作用

5.2.6竹叶黄酮对抗高钾的作用

5.2.7鸟苷酸环化酶抑制剂(亚甲基蓝)对竹叶黄酮诱导舒张兔胸主动脉环的影响

5.2.8一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对竹叶黄酮诱导血管舒张作用的影响

5.2.9环氧合酶抑制剂(吲哚美辛)对竹叶黄酮诱导血管舒张作用的影响

5.2.10竹叶黄酮与阳性药物硝苯地平的舒张作用比较

5.2.11竹叶黄酮对细胞外钙NO释放量的影响

5.2.12细胞外无钙条件下竹叶黄酮对NO释放量的影响

5.3讨论

第六章总结、创新点和展望

6.1主要研究成果总结

6.2创新点

6.3展望

参考文献

攻读博士学位期间主要的研究成果和获奖荣誉

致谢