菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒（CvBV）EP-1 like基因家族序列分析及EP-1 like 1基因表达研究

摘要

多分DNA病毒(polydnavirus，PDV)是一类与寄生蜂有专性互惠共生关系的特殊昆虫病毒，其基因的表达对抑制寄主免疫反应、保证寄生蜂卵发育有重要作用。EP基因家族是茧蜂科昆虫所拥有的PDV(茧蜂病毒Bracovirus，BV)的一个重要基因家族，具有重要的生理作用。本研究测定了菜蛾盘绒茧蜂病毒Cotesia vestalis bracovirus(CvBV)EP-1 like基因家族7个基因的cDNA全序列，并进行了序列分析。在此基础上，将EP-1 like 1(EPL-1)基因与原核表达载体pET-28a和pET-30a连接，从而构建、筛选了高效表达重组载体pET28-EPL-1，并在大肠杆菌中表达了EPL-1融合蛋白。采用传统割胶回收的方法回收纯化表达蛋白，并将纯化后的蛋白免疫新西兰大耳兔，制备了抗EPL-1多克隆抗体；以此多克隆抗体为基础研究了EPL-1基因在被寄生后寄主小菜蛾Plutella xylostella幼虫体内的蛋白含量变化；最后利用荧光定量PCR分析了EPL-1基因在寄主小菜蛾体内的转录动态。 本研究的主要结果如下： (1)应用cDNA末端快速扩增技术(RACE)的方法获得了EP-1 like基因家族7个基因的cDNA序列全长，相关推导蛋白氨基酸序列的翻译后加工和信号肽的预测分别采用网上搜索工具EXPASY和SignalP软件，发现CvBV编码的EP-1 like蛋白中虽然不存在保守功能域但N端都具有一个信号肽编码序列和众多的理论蛋白质修饰和功能位点。在利用BLASTP搜索获得同源蛋白后构建了以氨基酸序列为基础的进化树，由此发现CvBV编码的该基因家族成员之间关系并不密切，同时整个PDV编码的该基因家族成员之间可以划分成4个类群，其中EPL-1和EPL-2，EPL-3和EPL-4分别处于同一类群，但它们位于不同分支上。另外，EPL-5和CcBV early-expressed蛋白处于同一类群；EPL-7与部分GiBV和CcBV蛋白处于同一类群。 (2)将PCR扩增得到EPL-1基因ORF(921bp)克隆到表达载体pET-28a和pET-30a中，构建并筛选了高效表达重组载体pET28-EPL-1，在IPTG进行诱导的情况下，正确表达了分子量为34.8kDa的重组融合蛋白。在大量表达EPL-1蛋白的基础上，通过传统割胶回收、电透析的方法纯化表达蛋白并免疫新西兰大耳兔，制备了抗EPL-1蛋白的多克隆抗体(效价1：128,000)，同时用Western Blot检测了抗体的特异性。 (3)以制备的抗EPL-1多克隆抗体为一抗，间接ELISA法检测小菜蛾幼虫体内EPL-1蛋白含量变化。结果表明在被寄生的小菜蛾幼虫血浆和血细胞内EPL-1蛋白的含量都随时间的延长而增加，在寄生后第6天达到峰值。 (4)利用荧光定量PCR分析了CvBVEPL-1基因在寄主小菜蛾体内的转录动态，发现在被寄生6天内的小菜蛾幼虫体内都可以检测到EPL-1基因的转录，但是在寄生后寄主体内EPL-1基因的转录出现了2次转录高峰(2 d p.p.和5 d p.p.)；具体至寄生后寄主的脑、血淋巴和中肠时又发现其转录模式各不相同：在寄生后2h就能检测到该基因在寄主脑组织内的转录，转录高峰出现在12 hp.p.，此后转录水平迅速降低；在寄生后6h就能检测到该基因在寄主中肠中的转录，转录高峰出现在12 hp.p.，此后转录水平逐渐减低；在寄生后12h就能检测到该基因在寄主血淋巴中的转录，同时转录水平在寄生后的6d内持续上升。所以EPL-1基因在小菜蛾幼虫血淋巴内的转录水平是随着寄生后时间的延长而提高，这与EPL-1蛋白的含量变化动态相一致。

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致谢

引言

第一章文献综述

1多分DNA病毒(PDV)基本生物学特征

1.1 PDV的生活史

1.2 PDV基因组

2 PDV基本生理功能

2.1免疫抑制

2.2发育调控

3 PDV主要基因和基因家族研究现状

3.1姬蜂病毒(Ichnovirus，IV)基因家族

3.2茧蜂病毒(Bracovirus，BV)基因家族

4 EP基因家族研究现状

第二章基本实验材料和方法

1基本实验材料

1.1养虫设备

1.2供试材料

1.3实验仪器

1.4实验试剂

2基本实验方法

2.1 RNA提取

2.2 cDNA合成

2.3 PCR反应

2.4琼脂糖凝胶电泳

2.5凝胶回收目的片段

2.6连接反应

2.7感受态细胞制备

2.8质粒或连接产物转化感受态细胞

2.9质粒提取

2.10质粒双酶切

2.11重组质粒的筛选

2.12 SDS-PAGE电泳

2.13 Western Blot

2.14 ELISA

3实验常用试剂配制

3.1琼脂糖凝胶电泳缓冲液

3.2常用缓冲液

3.3 LB培养基

3.4 SDS-PAGE电泳试剂

3.5 Western Blot试剂

3.6 ELISA试剂

第三章CvBV EP-1 like基因家族成员序列分析

1实验材料

2实验方法

2.1引物设计

2.2 RACE

2.3产物纯化、连接T载体及鉴定

2.4生物信息学分析

3结果

2.1EP-1 like基因家族的分析

2.2蛋白序列功能位点预测及蛋白序列同源关系

2.3 EP基因家族系统蛋白质序列发生关系

4讨论

第四章CvBVEP-1 like 1(EPL-1)基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

1实验材料

2实验方法

2.1基因克隆

2.2重组表达载体构建

2.3诱导表达条件的优化

2.4 Western Blot鉴定

2.5表达蛋白纯化

2.6多克隆抗体的制备

2.7抗体效价和特异性检测

3结果

3.1 EPL-1基因克隆和重组载体的构建

3.2诱导表达条件优化及鉴定

3.3 Western Blot鉴定

3.4抗体效价测定

3.5抗体反应特异性

4讨论

第五章小菜蛾体内CvBV EPL-1蛋白含量变化和EPL-1基因转录动态

1实验材料

2实验方法

2.1多克隆抗体分析EPL-1蛋白在小菜蛾幼虫体内的表达动态

2.2 EPL-1基因荧光定量PCR

3结果

3.1 EPL-1蛋白在小菜蛾血淋巴内的含量变化

3.1 EPL-1基因转录时空动态

4讨论

第六章总结与讨论

1结论与讨论

2本研究创新之处

3不足之处

4努力方向

参考文献

附录硕士期间发表论文情况