二烯丙基三硫化物对人膀胱癌T24细胞体外作用及其机制的研究

摘要

本文主要就以下几部分展开： 第一部分:二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞增殖的影响 目的：研究大蒜提取物二烯丙基三硫化物(DATS)于体外对人膀胱癌细胞系T24细胞增殖和细胞周期的影响及其可能机制。 方法：采用MTT法观察不同浓度的DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用不同时间(24，48和72h)后对T24细胞增殖的影响。同时应用集落形成试验观察不同浓度的DATS(0，0.5，1，5，10，20和40μmol/L)对T24细胞集落形成的影响。T24细胞经不同浓度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用24小时后，采用流式细胞仪进行细胞周期分析。并应用Western blotting方法检测细胞周期相关蛋白Cde25C的表达，以观察DATS对其的影响。 结果： 1.DATS对T24细胞的增殖有明显的抑制作用，MTT法显示随着药物浓度升高(2.5～100μmol/L)和作用时间的延长(24～72h)其抑制作用逐渐增强，作用24h后，5～100μmol/L的抑制率范围为13％81％，而作用48h及72h后抑制率范围则分别升至250/～87％及31％-96％。呈明显剂量和时间依赖性。 2.DATS抑制T24细胞集落形成，随着浓度增高集落形成率逐步下降，浓度为20μmol/L时集落形成抑制率已达100％。 3.经流式细胞仪检测，不同浓度DATS(10～40μmol/L)作用T24细胞24h后，G2/M期细胞逐渐增多，表明DATS可引起G2/M期停滞，表现为剂量依赖性。 4.不同浓度DATS(10～80μmol/L)作用T24细胞24h后，Cdc25C蛋白表达随药物浓度增加逐渐降低。 结论： DATS能显著抑制T24细胞增殖和集落形成，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。DATS能显著抑制T24细胞中Cdc25C蛋白的表达，这可能是诱导T24细胞G2/M期停滞的分子机制之一。 第二部分:二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响 目的：研究DATS在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞凋亡的诱导作用，并探讨其诱导凋亡的相关信号通路等分子机制。 方法：研究DATS抗膀胱癌增殖作用是否为诱导细胞凋亡所致。用光学显微镜及荧光染色形态学观察经DATS作用后T24细胞产生的凋亡形态学改变。并应用流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)检测细胞凋亡率的变化。采用Western blotting方法检测不同浓度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用24小时后T24细胞中easpase-3、PARP等蛋白在诱导凋亡中的表达，同时进一步研究了诱导细胞凋亡的分子机理，包括细胞中抗凋亡的P13K/Akt通路及Bcl-2家族蛋白的表达。 结果： 1.DATS作用于T24细胞后明显诱导细胞凋亡并呈显著剂量依赖性。 2.光学显微镜显示不同浓度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用于T24细胞24小时后使其细胞密度呈剂量依赖性降低。同时观察到凋亡细胞所具有的典型形态学改变。 3.流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)检测不同浓度的DATS(10～80μmol/L)对T24细胞作用24h后细胞凋亡呈剂量依赖性增加。细胞发生坏死比例为0.2％～1.3％，而发生凋亡的比例为6.2％～20.0％，较之对照组0.3％明显为高，且呈剂量依赖性。其中早期凋亡细胞比例为4.8％～12.2％，晚期凋亡细胞比例为1.4％～7.8％，均较之对照组为高。 4.DATS作用于T24细胞后caspase-3和PARP均被激活，表现为procaspase-3的减少和裂解的PARP片段(89KD)出现，并呈显著的剂量依赖性。 5.DATS作用于T24细胞后p-PDKl，p-Thr308-Akt，和p-Ser473-Akt的表达逐渐降低，呈剂量依赖性，但t-Akt的表达不受影响。 6.DATS作用于T24细胞后Bax和BAD表达逐渐增高，Bcl-2和Bcl-xL的表达逐渐降低，呈显著的剂量依赖性。而且Bax/Bcl-2的比例逐渐增高，呈显著的剂量依赖性。 结论：DATS能诱导T24细胞凋亡，凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。DATS诱导产生凋亡的机理可能通过抑制T24细胞PI3K/Akt信号通路的激活从而调节Bcl-2家族等蛋白并最终诱导凋亡发生。 第三部分:二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响 目的：研究DATS于体外对人膀胱癌细胞系T24细胞侵袭转移能力的影响及其可能机制。 方法：应用MTT法检测DATS对T24细胞粘附纤维连接蛋白(fibronectin)能力的影响，应用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭实验检测DATS对T24细胞侵袭能力的影响，并应用划痕愈合试验检测DATS对T24细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR方法检测不同浓度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用24小时后的T24细胞中MMP-9 mRNA和MMP-2 mRNA的表达。采用Western blotting方法检测不同浓度DATS(10，20，40，和80gμmol/L)作用24小时后的T24细胞中MMP-9蛋白的表达。 结果： 1.粘附试验表明DATS(10～80gμmol/L)作用24小时后，能有效抑制T24细胞与细胞外基质的粘附，且随药物浓度增高，抑制作用增强。 2.划痕试验显示DATS作用不同时间(0，12和24小时)对T24细胞迁移力的影响随浓度增加和时间的延长而增强，呈剂量和时间依赖性。 3.侵袭试验表明DATS(10～80μmol/L)作用于T24细胞24h后，随着药物浓度的升高，T24细胞的侵袭力逐渐降低，呈剂量依赖性。 4.DATS可减少T24细胞中MMP-9 mRNA和蛋白的表达，随药物浓度增高而表达减少，呈剂量依赖性。 结论：DATS能显著抑制T24细胞的粘附、迁移和侵袭能力。DATS的侵袭转移抑制能力可能与降低MMP-9的表达有关。

目录

研究背景

第一部分二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞增殖的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第二部分二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第三部分二烯丙基三硫化物(DATS)对人膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

综述 大蒜化学成分对恶性肿瘤的化学预防作用

附录 攻读博士学位期间完成的论文和论（译）著

致谢