基于多种DNA序列和cpSSR的梨属(Pyrus L.)植物分子系统关系研究

摘要

梨属植物是蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)或梨亚科(Pomoideae)中的一个重要属。一般认为梨属植物的基本种有20个左右，被中国植物分类学家认可的原产中国大陆的梨属种(包括非基本种)有13个。由于梨属植物种间和种内杂交非常普遍，种间可以区别的性状特征有时不明显，因此单独基于传统形态学的分类方法很难确切判断种和分析种间的系统关系。化学成分、同工酶、花粉超微结构等研究手段对解明梨属植物种间关系也做出了重要贡献，这些信息虽然不易受环境影响但标记数量非常有限。目前还没有建立起完整的梨属植物内系统关系，许多可疑杂种或栽培种的起源问题仍存在争议。 本研究广泛选取了东亚原产为主的梨属种和代表品种为样本，应用不同来源的多种DNA序列及cpSSR分子标记试图从分子系统学的角度为阐明梨属内的系统关系、梨属植物分化过程中可能经历的进化史及杂种起源提供证据。主要结果如下： 1.通过PCR优化在包括44个梨样本和3个外类群(苹果属)的所有供试样本中得到了128条功能性ITS序列；而在普通PCR条件下，在若干样本中得到了42条ITS假基因序列。由于功能性拷贝序列分化度低(aw=2.6％)，个体内存在不同程度的多态性和可疑重组子，且个体内多态序列在系统树上并非单源，因此导出的系统结果复杂，支持率普遍较低，并没有预期地解决梨属植物种间关系，根据个体内功能性ITS序列多态性程度的高低仍揭示了不同种或品种的杂合背景，暗示了梨属栽培种的分化过程中存在网状进化和其它更复杂的进化史。在梨属植物中得到的ITS假基因序列因GC含量低、二级结构遭破坏，在普通PCR条件下被优先扩增。其序列与相应的功能拷贝序列差异度很大(15％)，在系统树上也独立组成单源群，因此推测其起源时间较早.根据不同起源可以将所得假基因分为两个谱系(lineage)，即ψa、ψb、ψc、ψd和ψe、ψf、ψf，ψg.其中、ψb、ψc、ψd为共同起源，进化速率较快，且基于这些序列导出的系统结果关系明确、支持率高，具有很大的潜力来重建梨属内系统关系.这些假基因序列呈中性进化，是应用分子钟进行分化时间估计的很好的资源，此外，一些“古老孑遗”的ITS假基因序列为阐明一些较原始的种的演化历程提供了宝贵证据。基于功能性ITS功能序列和ITS假基因序列的系统结构中，西方梨都为单源，与东方梨显著分开，支持东西方梨为独立分化的观点。 2.梨属植物Adh基因中存在长度各异的6个内含子区，本研究仅对包括内含子1和内含子2区的5’端650bp长的序列进行了分析。经大量克隆测序发现，梨属植物中至少存在4种主要的Adh位点：Adh1、Adh2、Adh3及Adh4和一种可疑的Adh5。Adh内含子1区长度变异较大，各Adh位点在此区分别共享了其特有的长度变异。不同Adh位点间的序列分化度较高，为8％-20％，而各位点内的序列分化度也较低(＜2％)。在大多数样本个体内，每个不同Adh位点都存在序列多态性，即存在多个同类Adh拷贝。其中属于Adh1、Adh2和Adh3的差异拷贝大多为单源；而来自Adh4(拷贝数最多)的个体内差异拷贝大多数为多源，因此导出的系统树结构与功能ITS序列相似，关系复杂，可能存在谱系筛选及基源拷贝未鉴定准确的原因。四个位点中Adh2因起源较晚，拷贝数较单纯，显示了较好的应用价值。从系统树结构和支持率看，低拷贝核基因初步显示了比功能性ITS序列更好的系统学潜力 3.两个叶绿体非编码区，trnL内含子及trnL-F，在梨属植物中高度保守，未能预期解决梨属内系统关系，从系统树结构看，东西方梨两大组再次显著分开，而西方梨样本仅存在一种trnL-F序列的长度类型，多样性简单且与苹果属关系更近。而东方梨存在三种序列长度类型，多样性较丰富。这两个叶绿体非编码区的长度突变和核苷酸突变为一些杂种的母系提供了依据，如‘库尔勒香梨’的母本非西洋梨；褐梨、河北梨及部分秋子梨间关系密切；中国白梨品种并非起源于P.breteschneideril(罐梨)，两者不存在直接联系.在东方梨中秋子梨显示了最丰富的多样性。 4.应用12对cpSSR引物对供试梨样本进行分析发现仅4对引物的PCR产物在梨属中存在多态性。最后共获得14个多态位点，基于这些位点构建的UPGMA系统树结构与两种叶绿体非编码区序列的系统结果基本相似。

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致谢

第一章文献综述

1.1 分子系统学(Molecular phylogenetics)

1.1.1分子系统学的概念和发展史

1.1.2分子系统学的理论基础

1.1.3植物分子系统学方法

1.2 DNA序列在高等植物分子系统研究中的应用概况

1.2.1叶绿体基因组DNA(cpDNA)

1.2.2核基因组DNA(nDNA)序列

1.2.3线粒体基因组(mtDNA)

1.3 DNA序列在蔷薇科系统研究中的应用现状

1.3.1 cpDNA序列

1.3.2 ITS

1.3.3 LCNG

1.4梨属植物系统关系研究进展

1.4.1梨属植物传统分类学概况

1.4.2梨属植物的分子系统学研究概况

1.5本研究的目的和意义

第二章ITS序列在梨属植物中的进化及其系统学价值

2.1 材料和方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 植物总基因组提取、扩增和测序

2.1.3 序列排列及其数据分析

2.1.4 ITS假基因序列判断

2.1.5 系统树构建

2.2 结果

2.2.1 PCR条件对梨属植物ITS扩增的影响

2.2.2 ITS序列长度及ITS假基因判断

2.2.3 ITS序列G+C含量、自由能、二级结构及替代模式

2.2.4 序列分化度

2.2.5 核苷酸多样性及中性进化检测

2.2.6 重组鉴定

2.2.7 系统分析结果

2.3讨论

2.3.1梨属植物中ITS假基因序列的鉴定

2.3.2梨属植物个体内ITS序列多态性(intra-individual ITS polymorphism)

2.3.3梨属植物中ITS假基因的起源

2.3.4 ITS假基因的系统应用性

2.4 小结

第三章梨属植物中Adh基因家族的分子进化及其系统学价值

3.1材料与方法

3.1.1植物材料

3.1.2扩增和测序

3.1.3序列分析

3.1.4系统分析

3.2 结果

3.2.1梨属植物中Adh基因结构

3.2.2基源拷贝(paralog)的初步鉴定

3.2.3重组子检测

3.2.4各Adh位点序列特征

3.2.5系统关系分析

3.3讨论

3.3.1梨属植物Adh基因家族的分子进化

3.3.2基于Adh数据的梨属植物系统推测

3.3.3Adh位点的系统发育应用性

3.4小结

第四章基于cpDNA序列的梨属植物系统关系研究

4.1材料与方法

4.1.1植物材料

4.1.2 mark、trnL-F和trnL内含子的扩增和测序

4.1.3序列分析及系统树构建

4.1.4二级结构预测

4.2 结果

4.2.1 matK序列

4.2.2 trnL内含子及trnL-F区

4.3讨论

4.3.1 matK

4.3.2梨属植物中trnL-F区缺失的形成及其系统应用性

4.3.3基于trnL及trnL-F的进化史推断

4.4小结

第五章梨属植物的cpSSR分析

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2 PCR扩增及其产物分离

5.1.3数据分析

5.2 结果

5.2.1梨属植物cpSSR多态性

5.2.2系统分析

5.3讨论

5.4小结

第六章总结与展望

参考文献

附表

作者简历