鸡白细胞介素18重组质粒的胚胎接种对IBDV DNA疫苗的免疫增强作用研究

摘要

白细胞介素18(Interleukin-18. IL-18)是由单核巨噬细胞系统的细胞分泌的一种细胞因子，在结构上属于IL-1家族，功能上与IL-12相似，且二者有协同效应。除了能够明显诱导Th1, NK, NKT细胞产生IFN-γ外，IL-18还可诱导诸如IL-2, GM-CSF及TNF-α等其它多种细胞因子的产生，增强NK细胞和CTL细胞的活性，上调细胞毒作用，促进T细胞增殖，在诱导Th1细胞的分化成熟过程和Th1细胞为主的细胞免疫反应中具有促进和调节作用。本实验室在2002年开展鸡白细胞介素18(ChIL-18)的研究，先后构建ChIL-18的原核表达质粒、真核表达质粒，在此基础上，对真核表达质粒pCI-ChIL-18表达产物进行生物学活性评价，并将其作为免疫佐剂进行了初步研究。本论文主要对真核表达质粒pCI-ChIL-18的胚胎接种进行了较为系统的研究，确认了该真核表达质粒的胚胎接种效果，并用建立的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测法对pCI-ChIL-18质粒在试验鸡的血液、脾脏和法氏囊中的动态进行了跟踪;同时，对胚胎接种pCI-ChIL-18增强IBDV DNA疫苗的增强效果进行了评价。
　　 通过对孵化率、平均囊指数、脾指数、外周血淋巴细胞增殖反应和白介素18蛋白水平表达的检测，评定了重组鸡真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的不同接种剂量和接种方法的效果。结果表明，pCI-ChIL-18质粒接种18胚龄鸡胚不影响孵化率，对鸡的生长发育无影响，不同的接种途径和接种剂量对鸡体内ChIL-18的表达有影响。与1日龄雏鸡肌肉接种比较，胚胎接种可明显促进外周血淋巴细胞的早期增殖，而且呈剂量依赖，但相同接种途径的200μg接种组与300μg接种组间无统计学差异(P>0.05)。提示pCI-ChIL-18接种18胚龄鸡胚是安全的，200μg尿囊腔接种是最佳方案。
　　 以常规PCR产物为标准品，分别通过熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳分析检测特异性，对各PCR产物进行梯度稀释后作为模板进行敏感性试验，建立了基于SYBR GreenⅠ染料技术的ChIL-18基因实时荧光定量PCR方法。利用已建立的方法对胚胎接种pCI-ChIL-18鸡不同时间点质粒的动态变化进行检测，结果表明，建立的PCR具有特异性强、灵敏度高、快速等特点。试验组鸡在pCI-ChIL-18质粒经胚胎尿囊腔接种后，孵出时((0h)血液中就能检测到高浓度ChIL-I8的存在(2.05×106 copies/μl)，后随着试验鸡日龄的增加，血液中ChIL-18的浓度随之下降。提示胚胎接种pCI-ChIL-18使ChIL-18在鸡血液中早期持续高浓度存在，有利于机体早期免疫应答能力的增强。
　　 以鸡GAPDH基因的核苷酸序列，建立了基于SYBR Green I染料技术的鸡GAPDH基因实时荧光定量PCR方法。利用建立的检测方法结合ChIL-18基因实时荧光定量PCR方法，对鸡白细胞介素18在脾脏和法氏囊中基因表达水平进行检测。结果表明，在孵出后0h～22d，试验组鸡只脾脏中ChIL-18基因表达水平明显高于对照组;试验鸡在孵出时(0 h)，法氏囊中ChIL-18基因的表达水平(3.10×104copies/106 cells)就显著高于空白组(P<0.05)，后缓慢下降，至18d时和对照组无显著差异(P﹥0.05)。提示胚胎接种pCI-ChIL-18重组质粒，可促进鸡脾脏和法氏囊中pCI-ChIL-18基因的早期大量表达，有利于机体早期免疫应答能力的增强。
　　 为进一步评价胚胎接种pCI-ChIL-18的免疫佐剂作用，用pCI-ChIL-18与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫18胚龄SPF鸡胚，设1日龄雏鸡肌肉免疫对照组和空白对照组，2周龄时二免，6周龄时用IBDV标准强毒株BC6/85攻击。研究表明，胚胎免疫pCI-ChIL-18能显著促进试验鸡T、B淋巴细胞的早期增殖反应，增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的早期抗体水平。胚胎免疫pCI-ChIL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的早期免疫效果具有显著的增强作用((p﹤0.05)。
　　 综上所述，真核表达质粒pCI-ChIL-18通过胚胎免疫可在鸡血液中早期持续高浓度存在，促进鸡脾脏和法氏囊中ChIL-18基因的早期大量表达，显著增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的早期免疫效果，为胚胎免疫pCI-ChIL-18的使用提供依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部 分文献综述

第一章 禽细胞因子及鸡白细胞介素18的研究进展

1 禽类细胞因子

2 鸡自细胞介素18的研究进展

3 参考文献

第二章 胚胎免疫的研究进展

1 哺乳动物的胚胎免疫

2 鸡的胚胎免疫

3 MD的胚胎免疫

4 参考文献

第三章 实时荧光定量PCR技术研究进展

1 实时荧光定量PCR技术的基本原理

2 实时荧光定量PCR技术的主要类型

3 实时荧光PCR的定量方法

4 荧光定量PCR技术在动物传染病病原体检测上的应用

5 参考文献

第二部分 研究内容

第四章 鸡白细胞介素18真核表达质粒(PCI-CHIL-18)胚胎接种的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第五章 用SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR法跟踪PCI-CHIL-18在血液中动态变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第六章 用SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR法跟踪鸡脾脏、法氏囊中白细胞介素18基因表达水平的动态变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第七章 胚胎接种CHIL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第三部分 总结与展望

1 结论及创新

2 不足与展望

第四部分 附录

附录1 常用缓冲液及试剂

附录2 硕士在读期间参与的课题及发表的论文

附录3 致谢