重组钩端螺旋体三联体抗原蛋白原核表达条件的优化和高密度发酵

摘要

背景和目的： 钩端螺旋体属于螺旋体目钩端螺旋体科钩端螺旋体属(Leptospira)的原核细胞型微生物，钩端螺旋体(简称钩体)，自然宿主众多，其中对人类危害最大的是鼠类、蛙类和家畜。钩体可在水中生存数周，人类通过接触随自然宿主尿液排出钩体的污染水源而引起钩体病。钩体病是全球流行最广、危害较大的人兽共患病。目前，接种疫苗是预防和控制钩体病最有效的措施。然而，钩体血清群、型众多，各个血清群、型抗体之间交叉保护作用较弱或无，目前普遍使用的钩体疫苗为根据当地流行的数种优势钩体血清群构成的多价钩体全细胞死疫苗，效果较差而且毒副作用大。因此，若能确定钩体属特异性抗原，对于钩体病预防和控制具有极为重要的现实意义。 现在研究证实OMPl1／2、lipL21和lipL32／1基因型包含了我国人群中流行最广的问号钩体血清群、型。各基因型重组表达产物免疫家兔可产生高效价的抗体，任一兔抗血清均能交叉凝集所有受试菌株并能阻断问号钩体黏附宿主细胞。因此，我们认为，OMPl1／2、lipL21和lipL,32／1基因产物是具有良好抗原性和免疫反应性的属特异性表面蛋白抗原。本实验室为了提高抗原的免疫原性、减少工程发酵次数和降低生产成本，进一步构建了rOMPL1／2-rLipL21和rLipL32／1融合基因的大肠杆菌表达系统。 大肠杆菌在重组蛋白生产的过程中占主导地位。其具有遗传性比较清楚、易培养、发酵周期短的优点、在高密度时氧气供应受限时是仍能生长的特性，成为重组基因表达良好宿主，大肠杆菌宿主已经被广泛的用于表达外源蛋白。利用大肠杆菌高密度发酵是提高重组外源基因高表达的一个有效途径，但是重组大肠杆菌的表达受很多因素的影响，为提高目的抗原的表达量，本实验目的是优化重组大肠杆菌生长条件和表达条件，使重组抗原蛋白实现高表达，为工业大规模发酵提供实验数据和参考，同时回收和纯化目的产物，进行免疫学鉴定。 实验方法： 活化保存的重组菌并鉴定，利用单因子实验和统计学方法设计实验优化不同因素对重组大肠杆菌生长和表达的影响，从而得最优的表达条件，并对工程菌质粒的稳定性，发酵过程的影响因素进行了研究，在前期实验和文献的基础上，进行中试，利用溶氧反馈的补料流加技术，实现重组大肠杆菌高密度表达，亲和层析纯化回收目的抗原，利用SDS-PAGE和Western鉴定产物。 结果： 在摇瓶实验中，在单因子实验的基础上我们采用基于中心复合设计的响应面分析方法获得了目的重组蛋白最优的表达条件是：pH7.9、0.20mol／L IPTG、诱导前时间2.5 h、诱导后时间5.83 h、诱导后温度31℃可获得最大表达量，在该条件下目的蛋白的产量比未优化之前提高了2.7倍，在此基础上我们利用溶氧反馈补料流加技术，在15h、30L发酵罐中获得了OD600值为105的菌体浓度，目的蛋白产量11.08g，极大地提高了产量，纯化回收目的蛋白经SDS和Western鉴定为具有良好免疫原性的目的蛋白。 结论： 本研究通过优化生长条件，我们获得了最佳的蛋白表达参数，成功的提高了重组大肠杆菌目的蛋白的表达产量。在此基础上的大肠杆菌高密度发酵也获得了很大的菌体密度，这为此后进行工业大规模发酵提供了实验依据，而且利用这些分析方法，能为以后重组宿主培养条件的优化提供可行的方案，不仅可以得到可靠的结果和最佳的条件，也能节约成本、节省人力和时间。

目录

前言

第一部分 重组大肠杆菌的摇瓶条件的优化

第二部分 大肠杆菌高密度发酵

讨论

展望

参考文献

重组大肠杆菌高密度表达综述

攻读硕士期间研究成果

致谢