肾上腺髓质素在链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠肾脏表达的研究

摘要

目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者常见的微血管病变，它与糖尿病视网膜病、神经病变一起为糖尿病微血管病变最危险的并发症，其确切的发病机制尚未完全阐明。本研究用成年雄性Sprague-Dawle大鼠尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制成糖尿病模型。大鼠4周后处死，以免疫组织化学SABC法确定大鼠肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)蛋白表达水平，用苏木精伊红染色法(hematoxylin eosin staining，HE staining)染色光镜观察糖尿病肾脏组织的形态变化，同时制作大鼠肾脏的电镜标本观察其超微结构的改变，研究链脲佐菌素( streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏中ADM的表达情况，探讨糖尿病肾病可能的发病机制，并为临床治疗糖尿病肾病提供理论依据和治疗方法。 材料和方法： 1.实验动物分组 成年雄性Sprague-Dawle大鼠20只，体重150-180 g，年龄2个月左右，随机分为正常对照组和糖尿病组，每组10只。 2.实验模型建立 正常组大鼠禁食10h后，尾静脉注射pH4.6，0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲液，剂量为3 ml/kg，作为对照组；糖尿病组大鼠禁食10h后，用pH4.6，0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲液溶解STZ，配成1％溶液，3 ml/kg尾静脉注射，48 h后尾静脉取血用血糖检测仪测定血糖，以及尿糖试纸测尿糖，将血糖≥16.7 mmol/L，尿糖(++)以上的大鼠定为糖尿病模型建立成功的标准；所有动物造模后均自由进食进水，以后每周测尿糖和血糖。 3.免疫组织化学染色 (1)取材 造模成功后继续饲养4周；在4周后每组各取7只大鼠用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉；从左心室插管，用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)溶液灌注100 ml；接着用4％多聚甲醛(0.01 mol/L，pH7.4)溶液灌注300 ml后，取出肾脏在同种固定液中浸泡30 min，用PBS洗，以上操作均在4℃进行。 (2)切片制备 (3)免疫组化实验及显色 (4)贴片及封片 4.对照组用PBS代替一抗，其余步骤相同 5.HE染色 6.透射电镜观察肾脏组织超微结构 7.图像分析与统计学处理 同一放大倍数(×400)、同一光强度下分析所有切片，每组大鼠各选10张相同部位DAB染色切片，每张切片随机测量5个视野，测量结果取平均值；采用UTHSCSA Image Tools3.0(美国德克萨斯大学医学院开发)图象分析处理系统进行分析，统计切片单位面积内(mm2)阳性细胞的数量和光密度；数据采用SPSS10.0进行统计学处理，结果以x±s表示，采用t检验，p<0.05为显著性差异。 结果： 1.体重、血糖与尿糖：糖尿病大鼠建模前，对照组体重164.2±6.3 g，血糖3,7±0.5 mmol/L，尿糖(-)；糖尿病组体重167.2±7.9 g，血糖3.6±0.4mmol/L，尿糖(-)。两组间无显著性差异(P>0.05)。成模后4周：对照组体重223.8±12.1g，血糖3.9±0.5 mmol/L，尿糖(-)；糖尿病组体重159.1±18.1g，血糖30.4±2.8 mmol/L，尿糖(++)到(+++)。两组差异有显著性意义(P<0.01)。 2.肾脏ADM的表达情况：浅棕黄色ADM免疫阳性颗粒在对照组与糖尿病组大鼠肾小管上皮细胞的胞浆内均出现。但与对照组相比，糖尿病组ADM染色增强。具体而言，对照组大鼠肾脏单位面积ADM免疫阳性细胞数和光密度值分别为59.1±14.6/mm2和84.2±8.4，而糖尿病组肾脏单位面积ADM免疫阳性细胞数和光密度值分别为197.3±47.4/mm2和117.8±12.9(P<0.01)。 3.肾脏光镜下HE染色的观察：光镜下肾小球的毛细血管球肥大，肾小囊腔呈裂隙状，基底膜轻度增厚，系膜增生，肾小管上皮细胞显示空泡和颗粒变性。肾小管出现轻度扩张，肾小管之间间质增宽。 4.肾脏电镜下超微结构的变化：电镜下：肾小球毛细血管基底膜呈节段性增厚，上皮细胞部分足突融合、增宽，线粒体明显肿胀，嵴突数目减少或断裂，纤毛破坏，肾组织系膜细胞局部核内染色质趋边浓缩、聚集。 讨论： 1.糖尿病大鼠模型制作的研究 建立一种理想的糖尿病动物模型，对于深入研究糖尿病具有重要意义。一般常用四氧嘧啶或链脲佐菌素(STZ)腹腔注射一次成模，通常为速发型大鼠糖尿病模型。其中，STZ的成模更为常用。STZ能直接破坏胰岛B细胞，首先将其DNA碱基上的特殊位点烷基化，之后再进一步作用于ADP核糖体合成酶，从而使B细胞损伤。对于糖尿病大鼠血糖值的确立标准，通过国内外学者的深入研究，基本倾向于血糖值>16.65 mmol/L(300mg/dl)。本实验选用SD大鼠空腹10小时，一次尾静脉注射STZ3ml/kg，成模4周时血糖值达血糖≥16.7 mmol/L以上，并出现多饮、多尿、多食及体重增加不明显等症状，符合速发型糖尿病大鼠模型标准。 2.糖尿病肾病的病理结构变化 DN典型的病理结构变化为肾脏体积增大和肾小球肥大，并逐渐出现肾小球基底膜增厚以及进行性肾小球胞外基质(extracellular matrix，ECM)成份的聚集，最后肾小管间质细胞外基质(ECM)进行性积聚。而本研究观察到光镜下肾小球的毛细血管球肥大，肾小囊腔呈裂隙状，基底膜轻度增厚，系膜增生，肾小管上皮细胞显示空泡和颗粒变性。肾小管出现轻度扩张，肾小管之间间质增宽，肾小球毛细血管基底膜呈节段性增厚，上皮细胞部分足突融合、增宽，与文献报道一致。 3.肾上腺髓质素与糖尿病肾病的关系 ADM是在1993由Kitamura等首次从人嗜铬细胞瘤中分离提纯成功。近年来ADM在肾脏调节中的作用逐渐受到重视，高血糖可增加ADM的表达。这可能是因为高血糖激活了PKC的活性，使ADM表达增加，而在培养基中加入PKC的抑制剂，高血糖增加ADM表达的作用就被阻断。DM的高血糖及高FFA浓度可增加DAG的合成，进而激活PKC。而所以肾脏局部ADM表达的上升很可能是一种机体的代偿机制，以对抗糖尿病高血糖条件下代谢紊乱造成的各种损伤信号，如Ang II系统活化、氧化应激增强、PKC过度激活等对肾脏的不良作用。而长期慢性高血糖情况下发生的失代偿可能是DM大鼠血浆ADM水平先升高后降低的重要原因。另一项研究显示，DM大鼠血浆ADM水平呈现先升高后降低的变化趋势，而且ADM的血浆水平被认为可以反映DM病变的严重程度。而我们的研究首次证实，在STZ诱导糖尿病大鼠早期肾脏中ADM的表达水平是升高的，这说明ADM确实在糖尿病肾病的发生过程中具有重要作用，因为高血糖可以通过PKC刺激ADM的表达。本研究首次揭示了ADM在糖尿病肾病发病机制中的重要地位，而且也为临床上将ADM与PKC信号通路作为治疗糖尿病肾病的靶点提供了实验室依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

致谢

前言

1材料和方法

1.1主要仪器和试剂

1.2方法

2结果

2.1体重、血糖与尿糖：

2.2肾脏ADM的表达情况：

2.3肾脏光镜下HE染色观察：

2.4肾脏电镜下超微结构的变化

3讨论

参考文献

综述：肾上腺髓质素在糖尿病并发症中的作用

作者简历