小檗碱对高脂加链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其对G蛋白偶联受体激酶的调控

摘要

目的:
　　根据小檗碱(berberine,BBR)对糖尿病肾病大鼠(diabeticnephropathy,DN)肾脏病理形态学的改善及血糖血脂的调节,观察BBR对DN大鼠肾功能的保护作用,检测G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupledreceptorkinases,GRKs)的表达情况及BBR对其的影响;并初步探讨BBR对DN大鼠的作用特点及BBR对GRKs的影响与其保护大鼠肾功能的关系。
　　方法:
　　雄性SD大鼠先给予高脂饲料6周以后,在禁食不禁水12h条件下,一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)35mg/kg,诱导建立糖尿病模型。72h后测定空腹血糖值,以血糖值≥11.1mol/L纳入实验,符合条件的动物随机分为7组(n=10),即模型组、BBR组(50、100、200mg/kg)和阳性药对照组(依那普利、消渴丸和辛伐他汀),另设正常对照组和高脂对照组。持续每天一次灌胃给药(intragastricadministration,ig)并继续高脂饮食8周,实验期间观察大鼠的一般状况,每一周称大鼠体重,每两周尾尖取血测血糖。给药满8周后,将大鼠放入代谢笼中,收集24h尿液;然后股动脉采血,分离血清,检测大鼠的24h尿蛋白总量(UP24h)、24小时尿微量白蛋白(UMAlb)、尿肌酐(UCr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(SCr)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)。取大鼠肾脏,并称重,计算相对肾重(肾重/体重,KW/BW);光学显微镜观察HE染色及Masson染色后肾脏组织病理学变化;透射电镜下观察肾小球的超微结构;免疫组化法检测大鼠肾脏皮质纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、IV型胶原(collegentypeIV)、转化生长因子-1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)及结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的表达情况;Westernblotting法检测肾皮质的GRKs蛋白表达水平;放免法检测肾皮质中cAMP水平。
　　结果:
　　1、BBR对DN大鼠血糖水平和体重的影响
　　与正常组比较,DN模型组大鼠的血糖水平显著升高,BBR(100mg/kg,200mg/kg)组在给药第6～8周后,较模型组血糖显著下降。
　　从给药第2周开始,模型组大鼠的体重与高脂对照组相比明显降低;从给药第3周开始,模型组大鼠体重与正常对照组比较显著降低;各给药组及阳性对照组可减缓模型大鼠体重的下降,但差异均无统计学意义。
　　2、BBR对DN大鼠肾功能指标及血生化指标的影响
　　本实验结果发现,模型大鼠的KW/BW比值、微量白蛋白/尿肌酐比值(U.A/C)、总蛋白/尿肌酐比值(UP/C)、BUN、UCr、SCr、TG、TC、LDL-c水平比正常对照组显著升高,而HDL-c水平则显著下降;BBR(100mg/kg,200mg/kg)可改善DN大鼠的肾功能指标和生化指标水平的异常。
　　3、BBR改善DN大鼠肾脏组织病理学的表现
　　与正常对照比较,DN模型大鼠光学显微镜下可见肾小球体积明显增大,基底膜增厚及系膜基质增多,部分肾小管细胞肥大,管腔变窄;部分伴有大量炎性细胞浸润,肾间质部分小血管玻璃样变;并见大量绿色深染的胶原纤维沉积在肾小球和肾小管部分。BBR给药后,肾小球改变轻微,少数肾小管轻度扩张,系膜轻度增生,炎性细胞浸润减少,仅有少量胶原纤维沉积,间质纤维化区域与模型组相比有所减轻。各阳性对照组也有类似上述的改善作用。
　　4、BBR对DN大鼠肾组织超微结构的影响
　　电镜下观察发现,DN模型组与正常组相比肾小球肿胀变大,肾小球基底膜明显增厚,不平整,局部足细胞足突大片融合甚至消失;BBR(50,100mg/kg,200mg/kg)各给药组可不同程度地抑制肾小球基底膜增厚,有效地改善了足细胞的状态。
　　5、BBR降低DN大鼠肾脏组织中IV型胶原、FN蛋白、TGF-β1及CTGF的表达
　　免疫组化结果显示,BBR(100mg/kg,200mg/kg)给药组可显著降低IV型胶原、FN蛋白、TGF-β1及CTGF的表达。
　　6、BBR调节DN大鼠肾皮质中GRKs蛋白的表达水平
　　Westernblotting检测发现,与正常组相比,DN大鼠肾皮质中GRK2和GRK3表达明显升高,GRK4和GRK6蛋白表达有所降低;BBR(100,200mg/kg)给药可不同程度地下调DN大鼠肾皮质中增高的GRK2和GRK3蛋白表达水平,上调DN大鼠肾皮质中减少的GRK6蛋白表达水平,但对DN大鼠肾皮质中降低的GRK4表达水平没有明显影响,通过比较各组间GRK5蛋白表达均没有明显差异。
　　7、BBR对DN大鼠肾皮质中cAMP水平的影响
　　放免法结果显示,DN模型组大鼠cAMP水平较正常组明显降低,BBR可明显上调cAMP水平。
　　结论:
　　1.BBR给药6周前对DN大鼠血糖的影响不明显,给药6～8周后,较模型组血糖显著下降;BBR可改善U.A/C比值、UP/C比值、BUN、SCr等肾功能指标;BBR给药可减缓模型大鼠体重的下降,但差异无统计学意义。提示BBR对DN大鼠的作用特点体现在可明显改善肾功能指标,同时经过长时间的给药才能对DN大鼠血糖产生明显改善作用;且随着实验时间的延长,对体重影响不明显。
　　2.BBR给药8周后有效地改善了DN大鼠血生化指标,抑制肾脏IV型胶原、FN蛋白的过度产生和TGF-β1、CTGF炎性细胞因子水平,并改善U.A/C比值、UP/C比值、BUN、SCr等肾功能指标,从而减轻了糖尿病大鼠的肾脏进行性损害。提示BBR可阻止DN大鼠肾功能损伤。
　　3.DN模型大鼠肾皮质GRKs蛋白表达水平及cAMP水平均出现异常,BBR给药不同程度地调控GRKs的表达,同时上调cAMP水平。提示G蛋白-AC-cAMP信号转导通路可能与BBR对DN大鼠肾脏的保护作用有关。

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1 前言

2 实验材料

2.1 动物与饲料

2.2 药物和试剂

2.3 仪器与设备

3 实验方法

3.1 大鼠DN模型的诱导

3.2 分组及给药

3.3一般状况、体重和血糖值的测定

3.4 标本收集与指标检测

3.5 统计处理

4. 结果

4.1 BBR给药对DN大鼠的一般状况的影响

4.2 BBR对DN大鼠空腹血糖的影响

4.3 BBR对DN大鼠肾功能指标及血生化指标的影响

4.4 BBR对DN大鼠肾脏组织病理学的影响

4.5 BBR对DN大鼠肾小球超微结构的影响

4.6 BBR对DN大鼠肾脏组织中IV型胶原、FN蛋白、TGF-β1及CTGF表达的影响

4.7 BBR对DN大鼠肾皮质中GRK2、GRK3、GRK4、GRK5、GRK6表达的影响

4.8 BBR对DN大鼠肾皮质中cAMP水平的影响

5 讨论

5.1 BBR对STZ合并高脂诱导的DN大鼠的作用特点

5.2 BBR改善DN大鼠血生化指标，抑制肾小球ECM的过度堆积，阻止DN大鼠肾脏组织病变并保护肾功能与其调节GRKs的表达，上调cAMP水平的关系。

6. 结论

参考文献

附录

致谢

综述